Anwendungen der Polysomen-Sequenzierung in der biomedizinischen und Pflanzenforschung

Die präzise Regulation der Genexpression ist ein zentrales Mechanismus der Lebensaktivitäten, und die Effizienz der Translation, als ein entscheidendes Glied in der posttranskriptionalen Regulation, beeinflusst direkt die Proteinsyntheserate und die funktionale Vielfalt. Traditionelle Forschungen haben sich hauptsächlich auf die transkriptionale Ebene konzentriert, aber systematische Erklärungen zu zentralen Fragen, wie mRNA von Ribosomen erkannt wird und wie die Translationsrate dynamisch reguliert wird, fehlen weiterhin. Polysomsequenzierung (Polysome-seq), durch die Isolierung von mRNAs, die auf verschiedenen Ribosomen geladen sind, hat erstmals eine Quantifizierung der translationalen Aktivität auf Einzelmolekülebene erreicht und bietet eine neue Perspektive zur Aufdeckung von Krankheitsmechanismen, der Stressresistenz von Pflanzen und der biologischen Evolution. In den letzten Jahren haben bahnbrechende Entdeckungen in Bereichen wie der metabolischen Reprogrammierung von Krebs und den Reaktionen von Pflanzen auf abiotischen Stress ihren doppelten Wert in der Grundlagenforschung und praktischen Anwendungen hervorgehoben.

Dieser Artikel überprüft systematisch die technischen Prinzipien und aktuellen Anwendungsfälle von Polysome-seq, mit dem Ziel, seine vertiefte Anwendung in interdisziplinärer Forschung zu fördern.

Technische Prinzipien und Vorteile

Polysom-Sequenzierung, basierend auf der Sukrose-Dichtegradientenzentrifugation, nutzt den hohen Sedimentationskoeffizienten von Ribosomen, um mRNAs, die mit unterschiedlichen Ribosomen beladen sind, zu trennen: freie RNA, einzelne Ribosomen (80S) und Polyribosomen (mRNAs, die an mehrere Ribosomen gebunden sind). Quantitative Analyse jeder Komponente über RNA-Sequenzierung ermöglicht eine präzise Bewertung der Übersetzungseffizienz und die Erkennung von translationaler Aktivität in nicht-kodierenden Regionen (wie den UTR) und nicht-klassischen RNAs (wie lncRNA und circRNA).

Technische Vorteile

• "Goldstandard" für Übersetzungseffizienz: Spiegelt direkt die mRNA-Translationsaktivität wider, überlegen gegenüber anderen indirekten Methoden.
• Dynamische Überwachungsfähigkeit: Erfasst transkriptionale Veränderungen unter Stress, medikamentöser Behandlung und anderen Bedingungen, wie z.B. erhöhtem Ribosomenbindung an mRNA unter oxidativem Stress.
• Multi-dimensionale Integration: Kann mit RNA-seq und Epitranskriptomik (wie m7G-Modifikation) für eine gemeinsame Analyse kombiniert werden, um translationale regulatorische Netzwerke zu erhellen.

Anwendungen in der biomedizinischen Forschung

(1) Analyse des Krebsmechanismus

Chen Y et al., durch Polysom-Profilingzeigte, dass in MVD KD-Zellen der GPX4-mRNA-Gehalt in der Hochmultikorn-Gruppe (Gruppen 13-19, die aktiv translatiertes mRNA-Ribosomen-Komplexe repräsentiert) reduziert war, während der Gesamt-mRNA-Spiegel nicht abnahm.

Dieses Ergebnis bestätigt den hemmenden Effekt von MVD KD auf die GPX4-Translation – obwohl die Gesamtmenge an GPX4-mRNA unverändert blieb, nahm die Menge an aktiv übersetzter mRNA (multigranule-gebundener Zustand) ab, was darauf hindeutet, dass MVD die Translation von Selenoproteinen (wie GPX4) fördert, indem es tRNA-Modifikationen (wie die i⁶A37 tRNA-Modifikation) aufrechterhält, während ein MVD-Mangel zu einem Übersetzungsstopp führt und somit translationalen Beweis für die folgende Schlussfolgerung liefert, dass "MVD induzierte Ferroptose hemmt."

MVD förderte die CoQ10-Synthese und die Modifikation von Selenocystein-tRNA (Chen Y et al., 2025)

Du D et al. verwendeten Polysomen-Sequenzierung, m⁷G tRNA MeRIP-Seqund Ribo-seq Technologien zur Aufdeckung des Schlüsselmechanismus der METTL1-m⁷G tRNA-Modifikation und der Übersetzungsregulation in BC, die neue Ziele für die Behandlung von BC bieten (wie kombinierte CDK4/6-Inhibitoren):

• METTL1 reguliert die Translation von BC-assoziierten Genen (wie GADD45A und RB1) auf codonabhängige Weise.
• Die reduzierten Spiegel von METTL1-regulierten polynukleotidbezogenen mRNAs (wie GADD45A und RB1) bestätigen dessen translationalen Repressionseffekt.
• Kombiniert mit Ribo-seq wurde klargestellt, dass METTL1 selektiv die Translation während der G2/M-Phase des Zellzyklus durch m⁷G tRNA-Modifikation blockiert.
• Durch die Erhöhung der tRNA m⁷G-Spiegel wird die Translation von Schlüsselgenen wie GADD45A und RB1 gefördert, was den G2/M-Zellzyklus blockiert und die Proliferation von BC hemmt.

METTL1 erhöht die m7G tRNA-Methylierungslevels und die globale mRNA-Translation (Du D et al., 2024)

Um mehr über die Anwendungen der Polyribosomen-Sequenzierung in der Krebsforschung zu erfahren, beziehen Sie sich bitte auf "Anwendungen der Polysom-Sequenzierung in der Krebsforschung.

(2) Neurologische und Stoffwechselerkrankungen

Chak K et al. entdeckten mithilfe von Polysomen-Sequenzierung, qRT-PCR und Northern-Blot-Techniken gemeinsam den kompetitiven Mechanismus zwischen dem pre-miR-21 und dem reifen miR-21 und enthüllten dessen molekulare Grundlage zur Regulierung von TGFBR2/NT-3 bei Epilepsie:

• Pre-miR-21 und reifes miR-21 konkurrieren um Bindungsstellen im 3'UTR der TGFBR2-mRNA (überlappende energetische Vorteile), konkurrieren jedoch nicht um die NT-3-mRNA;
• Nachdem pre-miR-21 an die 3'UTR von TGFBR2 bindet, wirkt es der Degradation/Translationseinschränkung von TGFBR2 durch reifes miR-21 entgegen, was zu einer erhöhten TGFBR2-Expression und einer verringerten NT-3-Expression nach einem Anfall (SE) führt;
• Die Analyse der Polysomen-Sequenzierung ergab, dass pre-miR-21 im multisomalen Bestandteil der aktiven Translation lokalisiert ist, was darauf hindeutet, dass es die posttranskriptionelle Hemmung von miR-21 entgegenwirken und die Expression des TGF-β-Rezeptors verlängern sowie Epilepsie beeinflussen könnte.
• Das Verhältnis von pre-miR-21 zu reifem miR-21 ist ein zentraler Faktor, der die translationale Repression/Abbau bestimmter mRNAs (wie TGFBR2 und E2f6) reguliert. Ein Ungleichgewicht im Verhältnis von pre-/reifem miR-21 kann zu einer Krankheitsprogression (wie Epilepsie) führen.

Pre-miR-21 ist mit mRNAs assoziiert, die an aktiver Translation beteiligt sind (Chak K et al., 2016).

Um mehr über die Anwendungen der Polyribosomen-Sequenzierung in der Neurowissenschaft zu erfahren, konsultieren Sie bitte "Polysom-Sequenzierung in der Neurowissenschaft: Einblicke in die Translation im Gehirn".

Li Q et al., unter Verwendung von Polysom-Profiling in Kombination mit RNA-Stabilitätsanalysen, Protein-Stabilitätsanalysen und RIP-Technikenentdeckten, dass YTHDF1 die hypoxieinduzierte Autophagie und deren Fortschreiten bei HCC durch m⁶A-abhängige translationsregulatorische Mechanismen fördert. Ihre Ergebnisse sind wie folgt:

• YTHDF1-Knockout: mRNA von ATG2A/ATG14 verschiebt sich von der "Multimer (aktiver Übersetzungskomponente)" zu dem "Nicht-Multimer", was zu einem verringerten mRNA-Gehalt in der Übersetzungskomponente führt → translationaler Repressionsmechanismus;
• YTHDF1-Überexpression: ATG2A/ATG14-mRNA verschiebt sich zum "Multimer", was zu einem erhöhten mRNA-Gehalt im Translationskomplex führt → translationale Aktivierung.
• YTHDF1-WT (Wildtyp) kann ATG2A/ATG14 mRNA immunpräzipitieren, während YTHDF1-MUT (Mutation der m⁶A-Bindetasche) dies nicht kann. YTHDF1 bindet an die Ziel-mRNA über die m⁶A-Bindetasche.
• YTHDF1 fördert die Expression von autophagiebezogenen Genen ATG2A/ATG14 durch m⁶A-abhängige translationale Aktivierung und treibt damit die hypoxieinduzierte Autophagie, das Wachstum und die Metastasierung bei HCC voran.

Polysom-Profiling von hypoxischen SMMC7721- und Hep3B-Zellen (Li Q et al., 2021)

Um mehr über die Anwendungen der Polyribosomen-Sequenzierung in der Immunologie zu erfahren, beziehen Sie sich bitte auf "Polysom-Sequenzierung in der Immunologie: Translationale Regulation von Immunantworten.

Anwendungen in der Pflanzenforschung

(1) Abiotischer Stressreaktion

Juntawong P et al. entdeckten mithilfe von Polysomenprofiling in Kombination mit Immunopurifikation (IP), qRT-PCR und konfokaler Bildgebung die Assoziation zwischen dem Kälteschockprotein CSP1 (RNA-bindendes Protein RBP) von Arabidopsis und Ribosomen sowie dessen selektive translationale Regulation unter Stressbedingungen. Ihre Ergebnisse waren wie folgt:

• CSP1-Ko-Lokalisierung mit Ribosomen: Das epitop-markierte CSP1-FLAG (35S:AtCSP1-FH#11 Transgen) war nur in der multimeren Komponente (aktives Translationskomplex, das ≥2 Ribosomen enthält) vorhanden und nicht im niederdichten Monomer oder 40S-Untereinheit;
• Die globale Übersetzung blieb unbeeinflusst: Die Mehrkörperniveaus in transgenen Sämlingen waren ähnlich wie die in der Wildtyplinie Col-0, was darauf hindeutet, dass die Überexpression von CSP1 die gesamte Proteinsynthese nicht verändert.
• Änderungen unter Kälte-Stress: Nach einer Kältbehandlung bei 4°C nahm die Häufigkeit und die Ko-Lokalisierung von CSP1 zu, aber das globale Multi-Body-Niveau wurde nicht beeinflusst (Multi-Body-Niveaus sind unempfindlich gegenüber Temperaturen über dem Gefrierpunkt).
• CSP1 ist ein selektiver Übersetzungsregulator, der an Multimeren (aktiv übersetzende mRNA-Ribosomen-Komplexe) und spezifischen mRNAs (reich an G+C 5'UTR und beteiligt an der Zellatmung/Übersetzung) bindet. Unter Kältestress oder Wasserknappheit wird die Häufigkeit von CSP1 und die Kolokalisation von Multimeren erhöht, was die Übersetzung dieser mRNAs fördert und somit die Stressresistenz der Pflanzen erhöht. Seine Wirkung ist selektiv (beeinflusst nicht die globale Übersetzung) und hängt von seiner Assoziation mit Ribosomen ab.

CSP1 ist im Zellkern und im Zytosol lokalisiert und co-purifiziert mit Polysomen (Juntawong P et al., 2013).

(2) Regulierung der Fruchtreifung

Die Polysom-Profilierung wurde verwendet, um den Effekt des Knockouts von SlYTH2 (Tomaten m⁶A-Leseprotein) auf die Übersetzungseffizienz der Früchte zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass:

• Der SlYTH2-Knockout (slyth2-Mutant) veränderte nicht die Mengen der 40S- oder 60S-Ribosomenuntereinheiten, aber die Menge der 80S-Monomere (einzelne Ribosomen) nahm signifikant ab.
• Beginnend mit Segment 8 (das multiple Ribosomen darstellt, d.h. aktive Translationskomplexe mit ≥2 Ribosomen) nahm die Anzahl der Dimere, Trimere und Multimere im slyth2-Mutanten signifikant zu.
• Der Anstieg der Multimer-Spitzen (aktive Translationskomplexe) ging einher mit einem Rückgang der 80S-Monomere (inaktive Ribosomen), was darauf hindeutet, dass die Translationseffizienz der slyth2-Mutantenfrüchte überlegen war im Vergleich zu der des Wildtyps (WT).
• Polysom-Profilierungstechnologie Die regulatorische Rolle von SlYTH2 in der Translationseffizienz wurde direkt aufgedeckt: SlYTH2 verringert die Translationseffizienz von Zielgenen (SlHPL, SlCCD1B), indem es die Bindung von Multinukleotid-Polysomen hemmt; nach dem Knockout von SlYTH2 nimmt die Bindung von Multinukleotid-Polysomen der Zielgene zu, die Translationseffizienz verbessert sich und führt letztendlich zu einer Zunahme von aromatischen flüchtigen Verbindungen und einem verstärkten Fruchtaroma.

SlYTH2 hemmt die Übersetzungseffizienz von SlHPL und SlCCD1B und unterdrückt damit die Proteinakkumulation (Bian H et al., 2024)

Technischer Vergleich und Einschränkungen

Wesentliche Einschränkungen

• Hohe Probenaufnahme: Erfordert ≥1×10⁷ Zellen, was die Anwendung für Proben mit geringer Häufigkeit oder seltene Proben einschränkt.
• Mangel an Einzelzellauflösung: Aktuelle Protokolle sind noch nicht für die Einzelzellanalyse angepasst und basieren stattdessen auf der Profilierung auf Populationsebene.

Zukünftige Entwicklungsrichtungen

• Einzelzell-Polyribosomanalyse: Entwicklung von Mikromusterverarbeitungstechniken zur Analyse der zellulären Heterogenität.
• Multi-Omics-Integration: Kombination von m6A-seq und CRISPR-Screening um regulatorische Übersetzungsnetzwerke zu konstruieren (wie die Autophagie-Achse im Krebs).
• Dynamische Verfolgungstechnologie: Nutzung von Zeitreihenexperimenten zur Offenlegung vorübergehender Veränderungen in Übersetzungsereignissen, wie z. B. schnelle Regulation in Stressreaktionen.

Fazit: Polysome-seq, indem es die Übersetzungseffizienz und die Ribosomenverteilung quantifiziert, bietet ein unverzichtbares Werkzeug für die Forschung zu Krankheitsmechanismen, der Verbesserung von Nutzpflanzen und der Anpassung an die Umwelt. Mit dem Fortschritt der Einzelzelltechnologie und der Integration von Multi-Omics wird es eine noch größere Rolle in der Präzisionsmedizin und der agrarischen Biotechnologie spielen.

Referenzen

1. Chen Y, Lee D, Kwan KK, Wu M, Wang G, Zhang MS, Deng H, Cheu JW, Lau MH, Chan CY, Ooi ZY, Wu Y, Bao MH, Lo RC, Ng IO, Wong CM, Wong CC. Der Mevalonatweg fördert Leberkrebs, indem er Ferroptose durch die Produktion von CoQ10 und die Modifikation von Selenocystein-tRNA unterdrückt. J Hepatol. 2025 Dez;83(6):1338-1352.
2. Du D, Zhou M, Ju C, Yin J, Wang C, Xu X, Yang Y, Li Y, Cui L, Wang Z, Lei Y, Li H, He F, He J. METTL1-vermittelte tRNA m7G-Methylierung und translationaler Dysfunktion beschränken die Tumorigenese von Brustkrebs, indem sie die Zellzyklusblockade antreiben. J Exp Klin Krebsforsch31. Mai 2024;43(1):154.
3. Chak K, Roy-Chaudhuri B, Kim HK, Kemp KC, Porter BE, Kay MA. Erhöhtes Vorläufer-mikroRNA-21 nach einem Status epilepticus kann mit reifem mikroRNA-21 konkurrieren, um die Translation zu verändern. Exp Neurol2016 Dez;286:137-146.
4. Li Q, Ni Y, Zhang L, Jiang R, Xu J, Yang H, Hu Y, Qiu J, Pu L, Tang J, Wang X. HIF-1α-induzierte Expression des m6A-Lesers YTHDF1 fördert die hypoxieinduzierte Autophagie und Malignität des hepatozellulären Karzinoms, indem sie die Translation von ATG2A und ATG14 unterstützt. Signaltransduktion Zieltherapie2021, 23. Februar;6(1):76.
5. Juntawong P, Sorenson R, Bailey-Serres J. Kälte-Schock-Protein 1 chaperoniert mRNAs während der Translation in Arabidopsis thaliana. Pflanze J2013 Jun;74(6):1016-28.
6. Bian H, Song P, Gao Y, Deng Z, Huang C, Yu L, Wang H, Ye B, Cai Z, Pan Y, Wang F, Liu J, Gao X, Chen K, Jia G, Klee HJ, Zhang B. Der m6A-Leser SlYTH2 reguliert das Aroma von Tomatenfrüchten negativ, indem er den Übersetzungsprozess behindert. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024 Jul 9;121(28):e2405100121.