Anwendungen der CUT&Tag-Sequenzierung in der Epigenetik und Genregulation

CUT&Tag, mit seinem einzigartigen Design für gezielte Spaltung und In-situ-Bibliothekskonstruktion hat sich schnell zu einem neuen Paradigma in EpigenetikforschungIm Vergleich zu ChIP-seqEs beseitigt die Notwendigkeit von Quervernetzungen und Sonikation, benötigt nur eine Einzelzellprobe für Experimente und bietet eine Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses von über 50 %. Dies stellt ein neuartiges Werkzeug zur Aufklärung von Krankheitsmechanismen (wie der metabolischen Umprogrammierung von Krebs) und der Entwicklungsbiologie (wie der Differenzierung von Organoiden) dar.

Dieser Artikel zielt darauf ab, die technischen Prinzipien, grundlegenden Vorteile und neuesten Anwendungen von CUT&Tag systematisch zu überprüfen und anhand typischer Fälle in der Histonmodifikation, der Regulation von Transkriptionsfaktoren und Krankheitsmodellen zu erläutern, wie es die Epigenetik von "Populationsdurchschnitt" zu "Einzelzellpräzision" vorantreibt.

Technische Prinzipien und zentrale Vorteile

CUT&Tag (Cleavage Under Targets and Tagmentation) ist eine antikörpergeführte Forschungstechnologie zur Untersuchung von DNA-Protein-Interaktionen. Sie verwendet eine modifizierte Tn5-Transposase, um DNA in der Nähe der Bindungsstelle des Zielproteins zu spalten und gleichzeitig Sequenzierungsadapter hinzuzufügen, um direkt Sequenzierungsbibliotheken zu erstellen.

• Zu den wichtigsten Schritten gehören:
  • Antikörper-Zielbindung: Der primäre Antikörper erkennt das Zielprotein (wie Histonmodifizierer oder Transkriptionsfaktoren), und der sekundäre Antikörper verstärkt das Signal, bevor der Protein A/G-Tn5-Fusionsenzymkomplex eingeführt wird.
  • Gezielte Spaltung und Kennzeichnung: Das Tn5-Enzym spaltet DNA an der Zielproteinbindungsregion und fügt Sequenzierungsadapter ein, wodurch fragmentierte DNA in den extrazellulären Raum freigesetzt wird, was das Hintergrundrauschen erheblich reduziert.
  • Bibliothekskonstruktion und Sequenzierung: In der traditionellen ChIP-seq sind keine Quervernetzung oder Sonikationsschritte erforderlich; die Bibliotheksvorbereitung kann ausschließlich durch PCR-Amplifikation abgeschlossen werden, wobei der gesamte Prozess innerhalb eines Tages abgeschlossen ist.
• Technische Vorteile:
  • Niedrige Probenanforderungen: Die anfängliche Zellmenge kann so gering wie eine einzige Zelle sein (bei einigen optimierten Verfahren).
  • Hohe Signal-Rausch-Verhältnis: Gezielte Spaltung reduziert unspezifische Bindungen, was zu über 80% effektiven Daten führt.
  • Hohe Auflösung: In der Lage, feine Bindungsstellen im Bereich von 200-500 bp zu erkennen.
  • Breite Kompatibilität: Anwendbar auf verschiedene Forschungsszenarien, einschließlich Histonmodifikation, Transkriptionsfaktoren und Chromatinzugänglichkeit.

Für einen detaillierten Einführungsguide zur CUT&Tag-Sequenzierung konsultieren Sie bitte "Was ist CUT&Tag-Sequenzierung? Ein vollständiger Leitfaden für Anfänger".

Reproduzierbarkeit und Effizienz von CUT&Tag (Kaya-Okur HS et al., 2019)

Präzise Lokalisierung von Histonmodifikationen

Histonmodifikationen (wie H3K4me3, H3K27ac und H3K27me3) sind ein zentrales Mechanismus der epigenetischen Regulation, die die Genexpression durch Veränderung der Chromatinstruktur regulieren. CUT&Tag-Technologie, Durch antikörpergezielte Bindung und In-situ-Spaltung ermöglicht die hochauflösende Erkennung der Verteilung von Histonmodifikationen im gesamten Genom und liefert entscheidende „molekulare Marker“ zur Aufklärung der Regulierung der Genexpression.

• Organoid-Entwicklung: Duong P et al. entwickelten ein verbessertes CUT&Tag-Protokoll, um dessen Wirksamkeit bei der Analyse von Chromatinmodifikationen (unter Verwendung von H3K4me3 als Beispiel) während der Flossenregeneration bei adulten Zebrafischen zu überprüfen, was die dynamischen Veränderungen im regenerationsbezogenen Chromatin aufdeckte. In unverletztem Flossengewebe detektierte CUT&Tag nahezu 48.000 H3K4me3-Anreicherungsstellen. Während der kritischen Regenerationsphase (2 Tage nach der Regeneration) gewann der regenerationsspezifische Gipfel (FOS-Motiv) H3K4me3, während der unverletzungspezifische Gipfel (FOX/KLF-Motiv) H3K4me3 verlor, was die Reaktivierung des embryonalen Entwicklungsprogramms widerspiegelt. Die Chromatinzugänglichkeit nahm in Regionen zu, die H3K4me3 gewannen, während die Zugänglichkeit in denjenigen, die es verloren, stabil blieb, was synergistisch die Regeneration regulierte. Dieses Protokoll bestätigt die hohe Effizienz von CUT&Tag in epigenetischen Studien zur Regeneration und zeigt die Konsistenz und molekularen Eigenschaften der H3K4me3-Reprogrammierung sowie der Reaktivierung des Entwicklungsprogramms bei der Flossenregeneration auf.

• Mapping-Modifikationen: Zhong Z et al. verwendeten CUT&Tag Technologie zur Kartierung der genomweiten epigenetischen Regulation von H3K4me3 in dermalen Zellen (DPCs) von Shaanbei weißen Kaschmirschafen. Sie fanden heraus, dass die H3K4me3-Modifikation hauptsächlich in der Nähe des Transkriptionsstartpunkts (TSS) lokalisiert war; die chromosomale Peakverteilung zeigte eine weit verbreitete und relativ uniforme Modifikation, wobei die Signalintensität ±3 kb vom Peakzentrum eine annähernd normale Verteilung aufwies. Dies klärte die chromosomalen Eigenschaften des H3K4me3-Peaks (wie Peakbreite, Anreicherung, Signifikanz und Nähe zum TSS).

• Identifizierung spezifischer Ziele: Janssens, D.H. verwendete CUT&Tag, um die fusionsspezifischen Ziele verschiedener KMT2A-Fusionsproteine (wie KMT2A–AF9, KMT2A–ENL usw.) zu kartieren und gemeinsame sowie tumorsubtyp-spezifische Stellen abnormaler Chromatinregulation zu identifizieren; die Fusionsbindungsstellen waren angereichert mit aktiven Promotormarkern (H3K4me3, RNAP2S5p, H3K27ac) und genomischen Markern (H3K4me1, H3K36me3), wiesen keine Silenzierungsmarker (H3K27me3/H3K9me3) auf, und einige Stellen hatten bivalente (H3K4me3+H3K27me3) Eigenschaften. Einzelzell-CUT&Tag zeigte ihre interzelluläre Heterogenität (was auf eine Linienplastizität hindeutet).

Anpassung von CUT&Tag für die vollständige Automatisierung (Janssens DH et al., 2021)

Eine detaillierte Analyse der Regulation von Transkriptionsfaktoren

Transkriptionsfaktoren (TFs) regulieren die Genexpression, indem sie an Promotor- oder Enhancerregionen von Genen binden und somit als zentrale Knotenpunkte in der Regulierung der Genexpression fungieren. Die CUT&Tag-Technologie kann TF-Bindungsstellen mit hoher Auflösung identifizieren und wird kombiniert mit ATAC-seq (chromatin Zugänglichkeit) oder RNA-Seq (Genexpression), es zeigt das von TF vermittelte Genregulationsnetzwerk.

• Mechanismus der Follikelreifung: Zhang H. entdeckte mit CUT&Tag, dass Biomarker, die während des Eisprungs signifikant erhöht sind (wie Cyp11a1 und Star), ein starkes H3K4me3-Signal an ihren Promotoren aufwiesen, während dieses Signal in den Enhancer-Regionen, die durch H3K27ac verankert sind, abwesend war, was darauf hinweist, dass die Besetzung des Promotors eine zentrale Rolle bei der Chromatinzugänglichkeit während der Follikelreifung spielt. CUT&Tag von FoSl2 zeigte, dass FoSl2 in pGCs in verschiedenen Reifestadien signifikant verstärktes genomweites Signal aufwies; der durchschnittliche Motivscore des unterschiedlich besetzten Peaks war niedriger als der des konstitutiven Peaks, was darauf hindeutet, dass eine erhöhte FoSl2-Expression an Niedrigaffinitätsstellen binden kann. FoSl2 hat eine erhöhte genomweite Besetzungsrate, und seine einzigartige GC-aktivierte Zugangsregion (GAA) überschneidet sich in 75 % der Eisprünge mit dem FoSl2-Gewinnpeak. Es reguliert die Öffnung der GAA und die Expression nachgeschalteter Gene, erhält den Chromatinzustand und ist ein Schlüsselfaktor bei der Follikelreifung.

• AtSPL9 genomweite Zielverteilung in Arabidopsis: Tao XY et al. verwendeten die Kerne von 21 Tage alten Trieben für die B-CUT&Tag-Analyse und identifizierten 3183 Peaks, von denen 60%-70% mit den Peaks von Blütenstandproben übereinstimmten. Im Vergleich zu ChIP-seq (14 Tage alte Zweige): ChIP-seq erzeugte 5841 Peaks (entsprechend 4744 Genen), von denen 36,1% (1713 Gene) und 41,1% (1951 Gene) mit den Zielgenen von Blütenständen und Trieben in B-CUT&Tag überlappten, was darauf hindeutet, dass die Regulation von AtSPL9 räumliche (Blütenstand vs. Trieb) und zeitliche (21 Tage vs. 14 Tage) Variationen aufweist.

• Dynamik der GAF-Wiederherstellung auf neu synthetisiertem Chromatin: Wooten M et al. verwendeten das Neugeborene CUT&Tag-Technik um die Bindung von GAF (einem wichtigen Transkriptionsfaktor für die Drosophila-Entwicklung) an neu synthetisierte DNA zu analysieren. Die Gesamterholung zeigte, dass 40 % des GAF-Signals auf neu synthetisierter DNA schnell zurückgeholt wurden, während das verbleibende Signal innerhalb von 4 Stunden allmählich zurückkehrte. Die Analyse der Standortheterogenität offenbarte zwei verschiedene Erholungsmuster: Frühe Erholungsstellen (265 Stellen) zeigten ein geringeres Signal, kürzere GAF-Motive und schmalere Peakbreiten (Medianbreite 942 bp), angereichert mit zellzyklusbezogenen Funktionen, und wurden sofort besetzt, nachdem die Replikationsgabel hindurchgegangen war; späte Erholungsstellen (157 Stellen) zeigten ein signifikantes Signal, längere und degenerierte Motive sowie breitere Peakbreiten (Medianbreite 1603 bp), angereichert mit entwicklungsbezogenen Funktionen, und ihr Signal erreichte nach 4 Stunden sein Maximum.

• Downstream-Zielgen-Screening: Gao K et al. analysierten die genomischen Bindungsstellen des Transkriptionsfaktors XBP1s mithilfe der CUT&Tag-Technologie und identifizierten insgesamt 4723 signifikante Bindungsspitzen. Sie fanden heraus, dass die Bindungsmerkmale überwiegend im Promotorbereich lagen (nahezu 70 % der Spitzen befanden sich im Promotorbereich, und 66,48 % der Spitzen waren weniger als 1 kb vom Promotorbereich entfernt), was darauf hindeutet, dass XBP1s seine regulatorische Rolle hauptsächlich durch direkte Bindung an die Promotoren der Zielgene ausübt. Weitere Forschungen ergaben, dass MAP3K2, ein Schlüsselgen im MAPK/ERK-Signalweg, ein direktes downstream Zielgen von XBP1s ist. Die Überexpression von XBP1s erhöhte signifikant die mRNA- und Proteinspiegel von MAP3K2, während der Knockout (KO) von XBP1 dessen Expression signifikant hemmte und damit den epigenetischen Regulationsmechanismus der XBP1s-MAP3K2-MAPK/ERK-Achse bei endometritis-induzierter EMT (Epithel-Mesenchymale Transition) klärte.

CUT&Tag Die Analyse zeigt die nachgelagerten Genziele von XBP1s (Gao K et al., 2025).

Einzelzell-epigenetische Heterogenität

Die Einzelzell-CUT&Tag-Technologie, mit ihrer geringen Ausgangsmenge (100-1000 Zellen) und der Einzelzellauflösung, löst das Problem, dass traditionelle Bulk-Sequenzierung die zelluläre Heterogenität nicht auflösen kann, und zeigt die epigenetischen Unterschiede zwischen verschiedenen Zellunterpopulationen in komplexen Geweben auf.

• Multimodale Chromatin-Profilierung: Bartosovic M et al. entwickelten die nano-CUT&Tag (nano-CT) Technologie, die ein Nanobody-Tn5-Fusionsprotein verwendet, um gleichzeitig drei epigenomische Modalitäten (Chromatinzugänglichkeit ATAC, aktives Marker H3K27ac und repressives Marker H3K27me3) mit Einzelzellauflösung zu lokalisieren. Zu den Vorteilen gehören geringe Anforderungen an das Ausgangsmaterial (25.000-200.000 Zellen), eine 16-fache höhere Fragmentanzahl pro Zelle im Vergleich zu Einzelzell-CUT&Tag und eine deutlich verbesserte Sensitivität. Bei der Analyse von jungen Mäusehirnen wurde festgestellt, dass die gleichzeitige multimodale Detektion mehr Zelltypen/-zustände unterscheiden kann, die Chromatinbewegung der Oligodendrozytenlinie auflösen und die repressiven Wellen von H3K27me3 aufdecken, was die entscheidende Rolle der multimodalen Zusammenarbeit in der zellulären Heterogenität und den Differenzierungsdynamiken offenbart.

nano-CUT&Tag (nano-CT) (Bartosovic M et al., 2023)

Technologische Optimierung und modernste Anwendungen

Mit technologischen Fortschritten wurde CUT&Tag kontinuierlich optimiert, was zur Entstehung neuer Technologien wie Single-Cell CUT&Tag, Spatial CUT&Tag und Long-Read CUT&Tag führte und die Anwendungsgrenzen weiter erweiterte.

• Einzelzell-CUT&Tag: Durch die Kombination mit der Einzelzellplattform von 10x Genomics ermöglicht es die Analyse von Histonmodifikationen oder TF-Bindungsstellen auf Einzelzellebene und löst das Problem, dass traditionelle Bulk-Sequenzierung die zelluläre Heterogenität nicht auflösen kann.

• Räumliches CUT&Tag: Durch die Kombination mit der räumlichen Transkriptomik-Technologie ermöglicht es die in situ epigenetische Analyse von Geweben.

• Long-Read CUT&Tag: Durch die Kombination mit der Nanopore-Sequenzierungstechnologie ermöglicht es die langfristige epigenetische Analyse und löst das Problem, dass die Kurzlesesequenzierung komplexe genomische Regionen (wie sich wiederholende Sequenzen und strukturelle Variationen) nicht erfassen kann.

Fazit

CUT&Tag-Sequenzierung Technologie, als zentrales Werkzeug in Epigenetik und die Forschung zur Genregulation zeigt in mehreren Bereichen, einschließlich der Lokalisierung von Histonmodifikationen, der Regulierung von Transkriptionsfaktoren, der Analyse von Einzelzell-Heterogenität und der Erforschung von Krankheitsmechanismen, einen unersetzlichen Wert, aufgrund ihrer Vorteile wie geringer Ausgangsmengen, hohem Signal-Rausch-Verhältnis und schneller Effizienz. Mit der kontinuierlichen Optimierung der Technologie (wie Einzelzell-, räumlicher und langer Lese CUT&Tag) werden die Anwendungsgrenzen weiter erweitert, was ein leistungsfähigeres Werkzeug für die Präzisionsmedizin (wie Tumorimmuntherapie und Behandlung von Stoffwechselerkrankungen) bereitstellt. In Zukunft wird erwartet, dass CUT&Tag mit weiteren Omics-Technologien (wie RNA-seq, ATAC-seq und Proteomik) kombiniert wird, um eine vollständige Kettenanalyse von "Epigenetik-Genexpression-Zellfunktion" zu erreichen und eine umfassendere Perspektive zur Enthüllung des Wesens von Lebensphänomenen zu bieten.

Referenzen

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