Wie man DNA-Hydroxymethylierung (5hmC) in Pflanzengenomen untersucht?

Epigenetische Modifikationen spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Genexpression und verschiedener biologischer Prozesse in Pflanzen. Unter diesen Modifikationen hat die DNA-Hydroxymethylierung (5-Hydroxymethylcytosin oder 5hmC) aufgrund ihrer zunehmenden Bedeutung in der Pflanzenentwicklung, Stressreaktionen und Umweltanpassung erhebliche Aufmerksamkeit erregt. Das Verständnis der Verteilung und Dynamik von 5hmC in Pflanzengenomen kann entscheidende Einblicke in die epigenetische Regulation und Muster der Genexpression bieten. In diesem Artikel werden wir die Methoden und Techniken untersuchen, die verwendet werden, um die DNA-Hydroxymethylierung in Pflanzengenomen zu studieren.

Ein vermeintlicher Zyklus von Cytidin-Derivaten über Methylierung und oxidative Methylierung. (Mahmood et al., 2019)

Die Bedeutung der DNA-Hydroxymethylierung (5hmC) in Pflanzen

DNA-Hydroxymethylierung ist eine epigenetische Modifikation, die aus der enzymatischen Oxidation von 5-Methylcytosin (5mC) durch die Enzymfamilie der Ten-Eleven-Translokasen (TET) resultiert. Sie wurde als ein intermediärer Schritt im aktiven Demethylierungsprozess oder als stabiler epigenetischer Marker mit distincten regulatorischen Funktionen identifiziert. Das Vorhandensein von 5hmC in Pflanzengenomen wurde mit wichtigen Entwicklungsprozessen, Stressreaktionen und der Regulation von transponierbaren Elementen in Verbindung gebracht. Daher ist das Verständnis der Verteilung und der funktionalen Rollen von 5hmC entscheidend für das Entwirren der Komplexität der Pflanzenbiologie.

Vermutlicher enzymatischer DNA-Demethylierungsweg in Pflanzen. (Mahmood et al., 2019)

Immunopräzipitationsbasierte Techniken

a. Nutzung von 5hmC-spezifischen Antikörpern: Die Immunpräzipitation, kombiniert mit hochspezifischen Antikörpern, die auf 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) abzielen, stellt einen robusten Ansatz zur Durchführung umfassender epigenetischer Analysen in Pflanzengenomen dar. Diese leistungsstarke Methode ermöglicht die genomweite Profilierung von 5hmC und erhellt dessen Verteilung und potenzielle regulatorische Rollen. Nachfolgende Analysen, wie quantitative PCR (qPCR) oder Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq), erleichtert die präzise Kartierung von genomischen Regionen, die mit 5hmC angereichert sind, und entschlüsselt deren Assoziationen mit spezifischen genetischen Elementen, Genen oder regulatorischen Regionen. Forscher, die die epigenetische Regulation eines bestimmten pflanzlichen Entwicklungswegs untersuchen, verwenden 5hmC-spezifische Antikörper in der Immunpräzipitation, um genomische Regionen zu identifizieren, in denen 5hmC während verschiedener Entwicklungsstadien angereichert ist. Durch anschließende ChIP-seq-Analysen entdeckten sie, dass 5hmC signifikant in den regulatorischen Regionen wichtiger Gene angereichert ist, die an dem Weg beteiligt sind, was auf seine potenzielle Rolle bei der Modulation der Genexpression während der Pflanzenentwicklung hindeutet.

b. 5fC- und 5caC-Immunpräzipitation (hMeDIP-seq)Aufbauend auf dem Erfolg der 5hmC-Immunpräzipitationstechniken beinhaltet hMeDIP-seq die Verwendung von Antikörpern, die auf 5-Formylcytosin (5fC) und 5-Carboxylcytosin (5caC) abzielen, um diese DNA-Modifikationen zu erfassen. Durch die Integration von Immunpräzipitation mit Hochdurchsatz-Sequenzierung erhalten Forscher wertvolle Einblicke in die Verteilung und funktionelle Bedeutung von 5fC und 5caC im Pflanzengenom. Eine Gruppe von Forschern, die die Reaktion von Pflanzen auf Umweltstressoren untersucht, verwendet hMeDIP-seq, um Veränderungen in den 5fC- und 5caC-Modifikationen unter verschiedenen Stressbedingungen zu analysieren. Sie identifizieren spezifische genomische Loci, an denen sich die 5fC- und 5caC-Spiegel bei Stressaussetzung verändern, was diese Modifikationen möglicherweise in die adaptive Reaktion der Pflanze auf Umweltveränderungen einbezieht.

Chemische Kennzeichnung und Erfassung

a. Chemische Kennzeichnung und Affinitätsreinigung (hMe-Seal): Die hMe-Seal-Methode verwendet die chemische Kennzeichnung von 5hmC mit biotinylierte Glucosiden, gefolgt von einer Affinitätsreinigung mit Streptavidin-Perlen. Diese selektive Anreicherung von 5hmC-Regionen ermöglicht es den Forschern, ein tieferes Verständnis für deren Verteilung und funktionale Implikationen im Pflanzen-Genom zu gewinnen. Durch die Nutzung sequenzierungsbasierter Ansätze ermöglicht hMe-Seal eine detaillierte Charakterisierung von 5hmC-angereicherten Regionen und entschlüsselt somit deren Rolle in der Genregulation und Genomstabilität.

b. Oxidative Bisulfite-Sequenzierung (oxBS-Seq)Diese neuartige Technik nutzt die selektive chemische Oxidation von 5hmC zu 5-Formylcytosin (5fC), gefolgt von einer Bisulfidbehandlung. Die anschließende Hochdurchsatz-Sequenzierung ermöglicht die Unterscheidung zwischen 5mC und 5hmC und bietet einen umfassenden Überblick über die Hydroxymethylierungslandschaft des Pflanzengenoms. oxBS-Seq liefert wertvolle Einblicke in das Zusammenspiel zwischen DNA-Methylierung und Hydroxymethylierung und beleuchtet deren kombinatorische Effekte auf die Genexpression und die Pflanzenentwicklung.

Einzelmolekül, Echtzeit (SMRT) Sequenzierung

SMRT-Sequenzierung mit direkter Erkennung modifizierter Basen: Pionierarbeit von PacBio, SMRT-Sequenzierung steht an der Spitze der Technologien für Langlese-Sequenzierung. Dieser hochmoderne Ansatz ermöglicht die direkte Erkennung von modifizierten Basen, einschließlich 5hmC, ohne die Notwendigkeit einer Bisulfitbehandlung. Mit seinen erweiterten Lese-Längen eignet sich die SMRT-Sequenzierung hervorragend zur Untersuchung komplexer repetitiver Regionen, struktureller Variationen und epigenetischer Modifikationen im Pflanzengenom. Dies befähigt Forscher, die komplexen epigenetischen Landschaften zu entschlüsseln, 5hmC-assoziierte regulatorische Elemente zu identifizieren und das Zusammenspiel zwischen epigenetischen Modifikationen und dem Phänotyp von Pflanzen zu entschlüsseln.

Referenz:

1. Mahmood, Asaad M., und Jim M. Dunwell. "Beweise für neuartige epigenetische Marker in Pflanzen." AIMS Genetik 6.04 (2019): 070-087.