Erstellung und Nutzung von Phagen-Genomsequenzdatenbanken

Als die häufigsten biologischen Entitäten der Erde spielen Bakteriophagen (Viren, die Bakterien infizieren) eine entscheidende Rolle in der mikrobiellen Ökologie, der Pathogeneseforschung und therapeutischen Anwendungen. Hochdurchsatz- Phagenom-Sequenzierung hat schnell umfangreiche Datensätze phagen genetischen Materials generiert. Um diesen Reichtum an Informationen zu verstehen, sind Sequenzdatenbanken – wie PhageScope und PhagesDB – unverzichtbar für die Speicherung, Annotation und Visualisierung genomischer Daten. Im Gegenzug, während diese Datenbanken weiterhin neue hochwertige Sequenzen integrieren, erhöhen sie weiter die Leistungsfähigkeit und Präzision sequenzierungsbasierter Analysen und bilden einen positiven Kreislauf, der die moderne Phagen-Genomik untermauert.

Übersicht über die PhageScope-Datenbank (Wang RH et al., 2024)

Konstruktion der Bakteriophagen-Genomdatenbank

Die zentrale Herausforderung: Warum wir strenge Standards benötigen

Stellen Sie sich vor, Sie versuchen, eine globale Bibliothek zusammenzustellen, in der jedes Buch in einer anderen Sprache und einem anderen Format vorliegt. So war der Zustand der Phagen-Daten. Der Aufbau einer zuverlässigen Datenbank erfordert einen rigorosen, mehrschichtigen Ansatz, um Informationen aus verschiedenen Quellen zu standardisieren:

2. Vielfältige Datenakquisitionsquellen

2. Quelle-spezifische Verarbeitungsstandards

Öffentliche Datenbanken

• Screening: Automatisierte taxonomische Filter extrahieren Phagen-Einträge
• Compliance-Einstufung:
  • Zirkularisiert + annotiert
  • Hochwertiger Entwurf: N50 > 50 kb
  • Entwurf: N50 > 10 kb
  • Unmontierte Segmente
• Deduplication: CD-HIT-EST-Clustering (99% Identitätsgrenze)

Metagenomische vMAGs

• Identifikationspipeline:
  • VirSorter2 (markerbasiert)
  • DeepVirFinder (k-mer/AI-Vorhersage)
  • vRhyme (Kreuzproben-Binning)
• QC-Schwellenwerte: CheckV-verifiziert ≥50% Vollständigkeit + ≤10% Kontamination

Laborisolierte

• Einreichungsanforderungen:
  • Wirtstamm-Dokumentation (z. B. ATCC-Nr.)
  • EM-Strukturverifizierung
  • Experimentelle Validierung (Plaques/Wachstumskurven)
• Prioritätsbehandlung: Beschleunigte Überprüfung und hervorgehobene Anzeige

Entwürfe einreichen

• Vorläufiger Status: Temporäre ID mit einer Frist von 1 Jahr zur Vollständigung
• Versammlungsanreize: Bevorzugung von Hybrid-Nanopore+Illumina-Einreichungen
• Nichteinhaltung: Automatische Herabstufung auf den Status "Veraltet"

Jede Quelle durchläuft eine spezifische Verarbeitung und strenge Qualitätskontrollen, um sicherzustellen, dass sie einem definierten Grad entspricht – von "Vollständig" bis "Entwurf" – bevor sie in die Datenbank aufgenommen wird.

Der Maschinenraum: Wie Daten verarbeitet und annotiert werden

Nach der Erfassung müssen die Daten bereinigt, standardisiert und interpretiert werden.

Strenge Qualitätskontrolle:

Jedes Genom durchläuft einen mehrstufigen Validierungsprozess, um seine Vollständigkeit zu überprüfen und kontaminierende DNA von den Wirtsbakterien oder anderen Organismen zu entfernen.

• Bewertungsinstrumente:
  • CheckV: Quantifiziert Vollständigkeit (%) und Kontamination (%)
  • BUSCO (virales Gen-Set): Bewertet die Erhaltung von Kern-Genen
• Zertifizierungskriterien für den Status "Vollständig":
  • Terminalüberlappung ≥10 bp
  • ≥90% CheckV-Vollständigkeit
  • Vorhandensein von ≥4 zentralen viralen Genen (z. B. Terminase große Untereinheit, Kapsidprotein)

Hinweis: Entwürfe/MAG-Einträge müssen Integritäts-/Kontaminationsmetriken deutlich anzeigen.

2. Standardisierte "Kennzeichnung":

Jede Sequenz ist mit konsistenten, umfangreichen Metadaten versehen – wie dem Wirtsbakterium, den GPS-Koordinaten des Fundorts und dem Entnahmedatum. Dies verwandelt eine rohe Sequenz in eine bedeutungsvolle biologische Geschichte.

• FASTA-Header-Anforderungen:
  • Datenbank-ID|Wirt-Genus|Isolationsquelle|Datum[JJJJ-MM-TT]
  • PhageDB_KT003|Pseudomonas|Marine_Sediment|2023-05-17

3. Mindeststandards für Metadaten

4. Protokoll zur Kontaminationskontrolle

• Drei-Stufen-Filterung:
  • Primäre Screening: Entfernen von wirtsabgeleiteten Sequenzen (z. B. 16S rRNA) durch NT-Datenbankausrichtung.
  • Tiefe Klassifikation: Verwerfen Sie Contigs mit >5% nicht-viralen Übereinstimmungen mithilfe von Centrifuge.
  • Zielgerichtete Reinigung: Beseitigung von verbleibenden Wirtsfragmenten mit k-mer-Datenbanken (HostCleanse)

Vergleich der gängigen Phagen-Datenbanken

Von Rohdaten zu vertrauenswürdigen Informationen: eine kurze Beschreibung von Qualitätskontroll- und Standardisierungsprozessen.

1. Vorhersage des Kernfunktionselements

• tRNA-Identifikation: tRNAscan-SE v2.0 (-B -O Parameter)
• rRNA-Detektion: Barrnap v0.9 (Virusmodus: --vir)
• Nicht-kodierende RNA: Infernal + Rfam 14.0
• ORF-Vorhersage:
  • Prodigal v2.6 (prokaryotischer Modus: -p meta)
  • MetaGeneMark v4.0 (kreuzvalidiert)
  • Retention-Schwelle: CDS ≥30 Aminosäuren mit gültigem Startcodon (ATG/GTG)

2. Protokoll zur funktionalen Annotation

Gestuftes Aufgabensystem

• Primäre Annotation: Diamond BLASTP vs. PHROGS (e-Wert ≤1e⁻⁵, Abdeckung ≥70%)
• Sekundäre Annotation: InterProScan-Domainanalyse (Pfam/SUPERFAMILY)
• Tertiäre Annotation:
  • DeepFri strukturbasierte GO-Begriffzuordnung
  • Konfliktlösung: PHROGs > InterPro > UniProt-Hierarchie

3. Integrierte Vorhersage genomischer Merkmale

4. Analyse des CRISPR-Systems

• Spacer-Identifikation: CRISPRCasTyper v2.4.1
• Zielvorhersage: CRISPRTargetDB-Ausrichtung
• Anti-CRISPR-Gene: AcrFinder + benutzerdefinierte HMM-Profile

5. Qualitätssicherungs-Workflow

Workflow-Implementierung

• Automatisierte Phase: Standardisierte Verarbeitung über Pipeline-Manager
• Manuelle Intervention: Erforderlich für evolutionär signifikante Merkmale:
  • Erstbeschriebene Phagen-Wirt-Paare
  • Unannotierte Gencluster (≥3 aufeinanderfolgende unbekannte CDS)
  • Neue Anti-CRISPR- oder Toxin-Kandidaten

Mehrschichtige Metadatenarchitektur für Phagen-Genome

1. Kernmetadatenspezifikationen

• Speicherimplementierung:
  • In Sequenzdateien eingebettet: INSDC-konforme FASTA-Header (## Kommentarzeilen)
  • Strukturierte Datenbankspeicherung:

2. Ökologische und phänotypische Erweiterungen

Dynamisches Feldsystem (Optional, aber empfohlen)

• Hostbereich: Durch Kommas getrennte, verifizierte Hosts
  • Salmonella enterica, Escherichia coli
• Lytisches Profil: Quantitative Parameter
  • latent_period=20min; burst_size=150PFU
• Morphologie: Dokumentation mit zwei Komponenten
  • EM-Bildrepository-Links
  • ICTV-Klassifizierungscodes (z.B. Caudoviricetes; Siphoviridae)
• Stabilitätsdaten: Temperatur/pH-Toleranzbereiche

3. Ontologiegetriebene Standardisierung

• Kontrollierte Vokabulardurchsetzung:

Datenbankarchitektur und Implementierungsrahmen

1. Backend-Speichersystem

• Hybrides Datenmanagement:

2. Skalierbares Dateimanagement

• Sequenzspeicherung: FASTA-Dateien in HDF5-Blockkompression (70% Platzersparnis)
• Suchoptimierung:
  • Wöchentliche automatisierte BLAST-Indexaktualisierungen
  • Verteilte Diamant-Index-Sharding

3. Weboberfläche & API

• Erweiterte Suchfunktionen:
  • Sequenzähnlichkeit: BLAST/BLAT + MASH-Vorscreening
  • Kombinatorische Abfragen (z.B. "Terminases UND marine Wirte")
  • Filterung des taxonomischen Baums

4. Integrierte Visualisierungssuite

Zusammenfassung der wichtigsten Innovationspunkte

• Hierarchisches Management von dynamischen Daten
  • Automatische Einstufung basierend auf der Datenqualität (Vollständig/Entwurf/Veraltet)
  • Etablierung eines "Goldstandard-Datensatzes" für Laborstämme
• Garantie der vollständigen Prozessreproduzierbarkeit
  • Alle Versionen des Annotationswerkzeugs sind im Docker-Container festgelegt.
  • Bereitstellung des Workflows. YML für die lokale Neuanpassung des Benutzers.
• Multidimensionale Relevanzabruf-Fähigkeit
  • Unterstützung "Umwelt → Wirt → Phage → Genfunktion" durchdringende Abfrage
  • Integration von phylogenetischen Bäumen mit geografischen Informationssystemdaten
• Die "Dunkle Materie"-Strategie
  • Automatische Strukturvorhersage (AlphaFold2) für unbekannte Gencluster initiieren.
  • Einrichtung des "Phagen-Waisengen-Registers"

Für einen detaillierteren Ansatz zur Phagen-Sequenzierung beziehen Sie sich bitte auf "Phagenom-Sequenzierung: Methoden, Herausforderungen und Anwendungen.

Um zu sehen, wie die Illumina-Plattform Phagenbibliotheken tief sequenzieren kann, siehe "Tiefe Sequenzierung von Phagenbibliotheken unter Verwendung von Illumina-Plattformen".

Das Verständnis der Rolle von NGS-Daten in der Qualitätskontrolle von Phagen-Display-Bibliotheken kann referenziert werden.Qualitätskontrolle für Phagenanzeige-Bibliotheken mit NGS-Daten".

Entdeckungskraft: Wichtige Anwendungen für Forscher

• Präzise Taxonomie und Phylogenie: Über die Morphologie hinaus nutzen Datenbanken die Ganzgenomanalyse für eine genaue Klassifikation und großflächige evolutionäre Kartierung.
• Neuartige Phagenentdeckung: Sie erleichtern die Entdeckung neuer Phagen und einzigartiger Gene, einschließlich solcher zur Bestimmung des Wirtsspektrums und neuartiger Anti-CRISPR (Acr)-Systeme, die direkt in therapeutische Entdeckungsprogramme einfließen.
• Phagentherapie-Entwicklung: Sie dienen als primäres Screening zur Identifizierung von pathogen-targetierten Phagenkandidaten, zur Vorhersage des Wirtsspektrums und zur Durchführung kritischer Sicherheitsbewertungen für Lysogenie- und Virulenzgene.
• Metagenomische Analyse: Als essentielle Referenz ermöglichen sie Forschern, virale Sequenzen innerhalb komplexer Mischungen von DNA aus dem menschlichen Darm, den Ozeanen oder dem Boden zu identifizieren und zu klassifizieren.

Fallbeispiel: Verborgene Vielfalt entdecken

1. Taxonomie & Phylogenie

• Präzisionsklassifizierung
  • Ganzgenomähnlichkeitsanalyse mit VIRIDIC (ICTV-Standardmetriken)
  • Kern-Gen-Phylogenien, die morphologische Einschränkungen überwinden
• Evolutionskarte
  • Großangelegte phylogenetische Rekonstruktionen
  • Divergenzmusteranalyse über Phagen-Taxa hinweg

2. Neuartige Phagenentdeckung

• Bekannte Funktionen: Lyasen, Polymerasen, Terminasen, Wirtsspektrum-Determinanten
• Unbekannte Funktionen: PHROGs-Clustering + Identifizierung konservierter Domänen
• CRISPR-Systeme
  • Wirt-Spacer-Abgleich (historische Infektionen)
  • Neuartige Entdeckung von Anti-CRISPR (ACR) Genen

3. Entwicklung der Phagentherapie

• Kandidatenprüfung: Pathogen-zielgerichtete Phagenidentifikation
• Wirtbereichsprognose: Analyse von Rezeptor-bindenden Proteinen + Korrelation von Infektionsdaten
• Sicherheitsbewertung: Screening von Lysogenie/Virulenz/Antibiotikaresistenzgenen
• Entdeckung von Biokatalysatoren
  • Therapeutische Enzyme (Endolysine)
  • Spezialisierte DNA-Polymerasen

4. Grundlagen der Metagenomik

• Referenzrahmen
  • Binning und taxonomische Zuordnung
  • Funktionale Annotierungsbenchmark
• Virom-Exploration
  • Ökosystemstudien:
    • Darmmikrobiome
    • Marine Umgebungen
    • Boden Gemeinschaften

5. Einblicke in die vergleichende Genomik

• Modulare Evolution
  • Konservierungs-/Rekombinationsanalyse funktioneller Einheiten:
    • DNA-Replikationsmodule
    • Strukturelle Proteincluster
    • Verpackungssysteme
    • Wirtlysinsmaschine

Multifunktionale Validierung der Fähigkeiten der Phagen-Datenbank

1. Neuartige Phagenentdeckung und -klassifikation

• Hochsensitiver Nachweis: Neuartige Rhizobium RR1-ähnliche Phagen mit <30% Sequenzähnlichkeit zu bekannten Einträgen wurden über BLAST/BLAT identifiziert.
• Taxonomische Erweiterung: 733 Phagen aus 51 Familien katalogisiert unter Verwendung von Kern-Gen-Clustering und ICTV-Standards.

2. Nicht-Modell-Host-Anwendungen

• Fallstudie: Wilde Banane (M. balbisiana) & Seltene Genotypen (M. sikkimensis)
  • Ungeahnte Phagenvielfalt entdeckt
  • Validierte Datenbankkapazität für atypische Wirt-Phagen-Systeme

3. Analyse der Wirt-Virus-Interaktion

4. Funktionelles Gen-Mining

• Virulenzfaktor-Detektion: Identifizierte Holin- (Lyse) und Shiga-Toxin-Genfragmente durch die Integration von VFDB/PHROGs
• Therapeutisches Potenzial: Entdeckte Klebsiella-Phagen mit Markern zur Unterdrückung von Fusariumwelke durch die Analyse von AntiSMASH-Metaboliten

5. Nischenanpassungsprofilierung

• Gewebe-spezifische Verteilung
  • Blattnische: Höhere Phagenabundanz (ENVO:00005784 "Phyllosphäre")
  • Wurzel-Nische: Größere Vielfalt (Shannon-Index >4,2)
• Endogene vs. Transiente Virusdiskriminierung
  • Klassifizierte 56 Badnavirus-Stämme mit den Tags "Pflanzenendophyt" vs. "Umweltparasit"

6. Wissenslücken als Entdeckungskatalysatoren

• Annotierungsdefizite
  • 1.038 uncharakterisierte Protein-Domänen enthüllen neuartige virale Linien (Aghdam SA et al., 2023)

Vermutliche Überlappung der Phagen-Gemeinschaft auf den niedrigsten taxonomischen Ebenen (Arten oder Isolate) innerhalb der Endosphären-Mikrobiome von 6 Musa-Genotypen (Aghdam SA et al., 2023)

Herausforderungen und zukünftige Richtungen

Anhaltende Herausforderungen

• Trotz erheblicher Fortschritte bleiben wesentliche Einschränkungen bestehen:
  • Datenqualitätslücken: Inkonsistente Standardisierung über Datensätze hinweg
  • Wirtrepräsentationsbias: Seltene Genome von Nicht-Modell-Wirten (z. B. unculturable Umweltbakterien)
  • Metadatenintegrationsbarrieren: Eingeschränkte Interoperabilität von ökologischen/expertimentellen Kontextdaten
  • Funktionale Wissensdefizite: Virale "dunkle Materie" (uncharakterisierte Gene), die über 70 % der vorhergesagten ORFs repräsentiert.

Strategische Entwicklungsprioritäten

• Intelligente Annotation Systeme
  • KI-unterstützte Plattformen, die kombinieren:
    • Automatisierte Vorhersage-Pipelines
    • Expertenkuratierungsoberflächen
• Phage-Wirt-Interaktionsatlas: Experimentell validierte Wirtspopulationsdatenbanken
• Multi-Omics-Ressourcenintegration

Einheitlicher Zugang zu:

• Implementierung von prädiktiver KI
  • Deep-Learning-Modelle für:
    • Aufklärung der Genfunktion
    • Wirtbereichsprojektion

Fazit

Phagenom-Datenbanken haben die Virusforschung grundlegend verändert, indem sie:

• Lösung von Herausforderungen im Datenmanagement
  • Ermöglichung einer effizienten Organisation exponentiell wachsender Sequenzdaten
• Beschleunigung von Entdeckungsanwendungen
  • Dient als kritische Infrastruktur für:
    • Neue antibakterielle Therapien
    • Werkzeuge der synthetischen Biologie
    • Ökologische Modellierung

Mit dem Fortschritt der Sequenzierungstechnologien und der Erweiterung globaler Datensätze werden diese Repositories unverzichtbar bleiben, um das volle biotechnologische Potenzial von Phagen zu erschließen. Ihre fortwährende Entwicklung verspricht beispiellose Einblicke in die virale Vielfalt, die Anpassungsmechanismen der Wirte und die Wege der therapeutischen Ingenieurwissenschaft.

Zugriff auf die zugehörige Datenbank:

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PhagesDB: https://phagesdb.org
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Die Leute fragen auch

Was ist die Datenbank für Bakteriophagen?

Willkommen bei PhageScope! PhageScope ist eine Online-Datenbank für Bakteriophagen, die umfassende Annotationen bietet, einschließlich Vollständigkeitsbewertung, Phänotyp-Annotation, taxonomischer Annotation, struktureller Annotation, funktioneller Annotation und Genomvergleich.

Was ist ein Pham in Phagen?

Mycobacteriophage-Gene, die miteinander verwandt sind, können in Phamilien (Phams) gruppiert werden, und die mosaikartigen Beziehungen können analysiert und dargestellt werden, indem pham-annotierte Genomkarten und Phamily-Kreise verwendet werden, die die Muster zeigen, welche Phagen Mitglieder bestimmter Phams enthalten.

Was ist die ICTVdB, die universelle Virusdatenbank?

Die Datenbank des Internationalen Komitees für die Taxonomie von Viren ist ein weltweit verfügbares taxonomisches Forschungsinstrument zum Verständnis der Beziehungen zwischen allen Viren.

Referenzen:

1. Fujimoto K. Metagenomdatenbasierte Phagentherapie für durch intestinale Bakterien vermittelte Krankheiten. Biosci Mikrobiota Lebensmittel Gesundheit2023;42(1):8-12.
2. Wang RH, Yang S, Liu Z, Zhang Y, Wang X, Xu Z, Wang J, Li SC. PhageScope: eine gut annotierte Bakteriophagen-Datenbank mit automatischen Analysen und Visualisierungen. Nukleinsäuren Forschungsberichte2024 Jan 5;52(D1):D756-D761.
3. Aghdam SA, Lahowetz RM, Brown AMV. Divergente endophytische Virome und Phagen-Genom-Repertoires unter Bananen (Musa) Arten. Front Microbiol. 2023 Jun 9;14:1127606.
4. Gauthier CH, Cresawn SG, Hatfull GF. PhaMMseqs: eine neue Pipeline zur Konstruktion von Phagen-Genfamilien mit MMseqs2. G3 (Bethesda). 2022 Nov 4;12(11):jkac233.
5. Wang RH, Yang S, Liu Z, Zhang Y, Wang X, Xu Z, Wang J, Li SC. PhageScope: eine gut annotierte Bakteriophagen-Datenbank mit automatischen Analysen und Visualisierungen. Nukleinsäuren Forschungen2024 Jan 5;52(D1):D756-D761.