Qualitätskontrolle für Phagen-Display-Bibliotheken mit NGS-Daten

Der Erfolg von Phagenanzeige-Screening beruht grundlegend auf der Qualität der Bibliothek. Traditionelle Qualitätskontrollen, die auf niedrigdurchsatzfähiger Sanger-Sequenzierung und funktionalen Stichproben basieren, versagen darin, die Zusammensetzungsvielfalt und Integrität umfassend zu bewerten.

Phagen Next-Generation-Sequenzierung (NGS) transformiert dieses Paradigma, indem es eine molekulare Charakterisierung durch Hochdurchsatz-Tiefensequenzierung ermöglicht. Dieser Ansatz erleichtert eine umfassende Bewertung über wichtige Qualitätsdimensionen hinweg.

Wesentliche Dimensionen der Qualitätskontrolle

1. Konstruktion und Vielfalt von Phagen-Display-Bibliotheken

Die Konstruktion der Bibliothek bestimmt grundlegend die Qualität der Phagenanzeige. Die Diversitätsniveaus beeinflussen direkt sowohl die Reichhaltigkeit als auch die Zuverlässigkeit der nachfolgenden Screening-Ergebnisse. Die traditionelle Diversitätsbewertung stützt sich typischerweise auf monoklonale Amplifikation. Im Gegensatz dazu liefert die NGS-Technologie schnell umfassende, genaue Diversitätsdaten durch Hochdurchsatz-Sequenzierung ganzer Bibliotheken.

NGS ermöglicht eine präzise Berechnung der individuellen Sequenzfrequenzen, was eine robuste Bewertung der Bibliotheksvielfalt und -abdeckung erleichtert. Eine optimale Bibliothek muss über ausreichende Vielfalt verfügen, um die Identifizierung von hochaffinen Kandidatenpeptiden oder -proteinen, die auf spezifische Moleküle abzielen, zu gewährleisten.

2. Quantitative Analyse und Abweichungserkennung

Die Tiefensequenzierung über NGS quantifiziert die Häufigkeit jeder Sequenz innerhalb einer Bibliothek. Das Erkennen von Abweichungen ist während der Qualitätskontrolle entscheidend. Häufige Probleme sind:

• Klone-Bias: Bestimmte Sequenzen können aufgrund von PCR-Amplifikationsartefakten unverhältnismäßig häufig auftreten. Die NGS-Analyse der relativen Sequenzhäufigkeit identifiziert solche angereicherten oder verzerrten Klone.
• Indels: Einfügungs- oder Löschfehler während der Bibliothekskonstruktion können zu fehlenden oder gekürzten Sequenzen führen. NGS identifiziert diese Defekte präzise und unterstützt die Verfeinerung der Konstruktionsprotokolle.

Identifizierung alternativer Binder im NGS-Datensatz (Nannini F et al., 2021)

3. Stabilität und Reproduzierbarkeit der Bibliothek

Konsistente Bibliotheksstabilität und Reproduzierbarkeit von Charge zu Charge sind entscheidend für zuverlässige Ergebnisse beim Phagen-Display-Screening. NGS erleichtert die vergleichende Analyse zwischen Bibliothekschargen und gewährleistet eine konsistente Bauqualität. Sequenzvergleiche zeigen, ob die Sequenzzusammensetzung über die Chargen hinweg stabil bleibt und erkennen unerwünschte Mutationen oder Kontaminationen.

4. Datenanalyse nach dem Screening

Nach den Screening-Runden ermöglicht NGS-Daten eine detaillierte Analyse der Anreicherungsresultate. Forscher identifizieren affin angereicherte Sequenzen, indem sie Veränderungen in der Sequenzhäufigkeit nach dem Screening analysieren. Wichtige analytische Schritte umfassen:

• Sequenzanpassung: Der Vergleich der gesichteten Sequenzen mit der ursprünglichen Bibliothek identifiziert Sequenzen, die eine erhöhte Häufigkeit (angereichert) oder eine Verringerung (eliminierte) aufweisen.
• Anreicherungsanalyse: Die Verfolgung von Änderungen der Sequenzhäufigkeit über aufeinanderfolgende Screening-Runden hinweg hebt Kandidatenpeptide oder -proteine hervor, die schrittweise als Hochaffinitätsbinder angereichert werden.

5. Datenqualitätsbewertung und Fehlerkontrolle

Die Qualität von NGS-Daten hat einen entscheidenden Einfluss auf die Zuverlässigkeit der Ergebnisse. Eine gründliche Bewertung während der Qualitätskontrolle der Bibliothek umfasst:

• Sequenzierungstiefe: Sicherstellung einer ausreichenden Abdeckung, um alle Bibliothekssequenzen genau zu erkennen.
• Datenqualität: Die Genauigkeit validieren, indem Ergebnisse mit bekannten Standards verglichen werden. Das Entfernen von Daten mit niedriger Qualität ist notwendig, um die analytische Zuverlässigkeit aufrechtzuerhalten.

Strukturelle Integritätsüberprüfung

Die Paar-End-Sequenzierung (2 × 150 bp) wurde verwendet, um das Insert und seine flankierenden Regionen abzudecken. Durch die Zusammenstellung der Reads wurden die folgenden kritischen Elemente authentifiziert: die Integrität des Signalpeptids (z. B. PelB); die Aufrechterhaltung des korrekten translationalen Leserahmens (Fehlen von Frameshift-Fehlern); die Reinheit der CDR-Regionen (frei von Stoppcodons); und die präzise Sequenz der funktionalen Tags (z. B. His-Tag/Myc-Epitop).

Vielfaltsquantifizierung und Bias-Diagnose

Kernqualitätsmetriken umfassen mehrere Kriterien. Die effektive Größe der Bibliothek, dargestellt durch die Anzahl funktionaler Klone, muss 10 % ihrer theoretischen Diversität überschreiten. Ein Shannon-Diversitätsindex von über 8 (auf einer log₁₀-Skala) ist erforderlich, um eine angemessene Verteilungsgleichheit zu bestätigen. Die Sequenztreue verlangt, dass positionsspezifische Mutationsraten und Codon-Nutzung weniger als 15 % Abweichung von den vorgesehenen Spezifikationen aufweisen. Darüber hinaus ist eine eingehende Abdeckungsanalyse für wichtige Funktionsregionen erforderlich.

Bewertungen spezifisch für Bibliothekstypen

1. Antikörper/Nanokörper-Bibliotheken:

Die Bewertung umfasst die Überprüfung der Abdeckung von CDR-Mutationen (z. B. Sicherstellung, dass die Längenverteilung von CDR-H3 mit dem Design übereinstimmt), die Analyse der Häufigkeit der Verwendung von Keimbahn-Genen zur Erkennung unbeabsichtigter Amplifikationsverzerrungen und das Screening nach potenziellen Stabilitätsrisiken wie aggregationsanfälligen hydrophoben Bereichen, unpaarigen Cystein-Resten oder unerwünschten Glykosylierungsmotiven.

2. Peptidbibliotheken:

Die Bewertung umfasst die Erkennung abweichender Anreicherung von Sekundärstrukturen (z. B. α-Helix/β-Faltblatt) unter Verwendung der Analyse von positionsspezifischen Bewertungsmatrizen (PSSM). Auch die Integrität wichtiger funktioneller Motive, wie z. B. Protease-Spaltstellen und die Fähigkeit zur Bildung von Disulfidbrücken, wird bewertet.

Funktionale Vorscreening und strukturelle Vorhersage

Integrierte rechnergestützte Ansätze werden für die in silico Analyse verwendet. Beispielsweise werden konformationale Simulationen an aus NGS abgeleiteten CDR3-Sequenzsätzen (z. B. 10.000 Varianten) mit Werkzeugen wie NanoNet oder RoseTTAFold durchgeführt. Diese Simulationen sagen die Topologie von Bindetaschen voraus (indem sie diese als konvex, konkav oder flach klassifizieren). Darüber hinaus werden Klone auf elektrostatistische Komplementarität zur Ladungsverteilung des Epitope des Ziels gescreent.

Standardisierter Qualitätskontrollworkflow

Eine schrittweise Implementierung der Qualitätskontrolle wird empfohlen:

• Post-Konstruktion: Es sind mindestens 1 Million Reads erforderlich, um die Einfügequote, die Integrität des Leserahmens und das Vorhandensein von Stoppcodons zu bewerten.
• Post-Amplifikation: Mindestens 5 Millionen Reads sind erforderlich, um den Diversitätsindex zu bewerten und eventuelle klonale Präferenzen zu identifizieren.
• Vor-Panning: Eine funktionale Konformationsbewertung sollte an mindestens 10.000 repräsentativen Sequenzen durchgeführt werden.

Weitere Informationen zu phagenbibliotheken, die durch Next-Generation-Sequencing verbessert werden, finden Sie hier: "Phagenanzeige und NGS: Wie Next-Generation-Sequencing Phagenbibliotheken verbessert".

Um zu sehen, wie die Illumina-Plattform Phagenbibliotheken tief sequenzieren kann, siehe "Tiefensequenzierung von Phagenbibliotheken mit Illumina-Plattformen".

Umfassender Fall 1: NGS-gesteuerte Qualitätskontrolle bei der Peptidauswahl

Einrichtung der Basisbibliothekscharakterisierung

Die Sequenzierung der ursprünglichen naïven Bibliothek etablierte ein Referenzprofil für die Häufigkeiten von Aminosäuren und deren positionsspezifischen Präferenzen (z. B. Serin bei 10,8 %, L-Cystein unter 1 % gehalten). Diese Analyse identifizierte auch einen Frequenzgradienten von Arginin/Lysin am N-Terminus, wobei die niedrigste Häufigkeit an Position 1 bis zur höchsten an Position 12 ansteigt.

Überprüfung der Integrität der Bibliothek

Die Analyse von 521.981 Sequenzen bestätigte ein hohes Maß an Genauigkeit, mit über 95 % Übereinstimmung zwischen den synthetisierten Sequenzen und den entworfenen Codons. Die Bewertung erkannte auch strukturelle Anomalien, einschließlich abweichender Stopcodons (die zu vorzeitigen Terminationen führen) und Frameshift-Mutationen, durch die Ausrichtung der flankierenden Sequenzen.

Dynamische Überwachung des Screening-Prozesses

NGS wurde eingesetzt, um die molekulare Evolution von 12 Komponenten über drei Biopanning-Runden hinweg zu verfolgen. Eine gezielte Anreicherung war offensichtlich: die Häufigkeit des QxQ-Motivs in eluierten Fraktionen stieg von 0,21 % auf 26,85 %. Diese Anreicherung war im starken Elutions- (Strip-)Fraktion noch ausgeprägter, wo das C-terminale QxQ-Motiv 92,6 % erreichte. Gleichzeitig deutete die Persistenz des HxH-Motivs in Waschfraktionen auf eine unspezifische Bindungspräferenz hin.

Quantifizierung des Amplifikationsbias

Eine vergleichende Analyse von Vor- und Nachverstärkungsbibliotheken zeigte eine Veränderung in der Aminosäurezusammensetzung. Es gab eine erhöhte Häufigkeit von polaren Resten (Thr/Ser) und eine Abnahme von hydrophoben Resten (Val/Ile). Eine bemerkenswerte Reduktion der Cystein-Häufigkeit – von 0,99 % auf 0,36 % – deutete auf eine mögliche Inaktivierung von Phagen hin, die möglicherweise durch die Bildung von Disulfidbrücken vermittelt wurde.

Wesentliche Ergebnisse der Qualitätskontrolle

1. Validierung funktioneller Motive:

pLogo- und MEME-Analysen lokalisierten das C-terminale QxQ (Positionen 10-12) als das kritische Arsen-Bindungsmotiv. Seine Häufigkeit stieg von 0,14 % auf 69,23 % während der Screening-Runden. Unabhängige Datenbankabfragen (48HD.Cloud) bestätigten, dass QxQ ein nicht-dominantes Motiv in natürlichen Bibliotheken ist, das etwa den 4500. Platz einnimmt.

2. Beseitigung von falsch positiven Ergebnissen:

Die Anwendung eines Kreuzsatzanalyse-Algorithmus (ES = (∩ Elution ∪ ∩ Stripping) ∩ (∩ Waschen ∩ ∩ Input)) filterte effektiv schnell proliferierende Klone heraus (z. B. solche, die das HxH-Motiv enthalten). Dieser Prozess identifizierte 13 hochkonfidente Zielpeptide, von denen 9 ein konserviertes xxMPxTxxGQVQ-Motiv enthielten.

3. Rückverfolgbarkeit von Mängeln:

NGS stellte die post-amplifikationsbedingte Depletion von hydrophoben aromatischen Rückständen (Phe/Tyr) fest. Die Hauptursache wurde auf den Aggregationsverlust zurückgeführt, der während des PEG/NaCl-Fällungsschrittes auftrat.

Wert des technologischen Durchbruchs

• Effizienz: NGS erfasste die Vielfalt der Bibliothek, indem 46 einzigartige Sequenzen (von denen 43 Einzelvorkommen waren) nachgewiesen wurden, eine Aufgabe, die die traditionelle monoklonale Validierung von 68 Klonen erforderte, um nur 3 Wiederholungen zu finden.
• Neuartige Erkenntnis: Die Analyse zeigte N-terminal positionale Effekte, einschließlich einer vollständigen Abwesenheit von Prolin an Position 1 (aufgrund sterischer Hinderung) und einer reduzierten Häufigkeit von Glutamat an den Positionen 1-4 (wo die negative Ladung die Zielbindung behindert).
• Gestaltungshinweise: Diese Erkenntnisse flossen direkt in das Design der nachfolgenden Bibliotheken ein und empfahlen die Einbeziehung eines C-terminalen L-Glutamin-Dupletts (QxQ) sowie die Vermeidung von N-terminalen negativ geladenen Resten (Braun R et al., 2020).

Visualisierung der relativen Häufigkeit der einzigartigen Sequenzen in der Kernfraktion ES–I–W\naï.lib (Braun R et al., 2020)

Umfassender Fall 2: NGS-Erkennung von Phagenanzeige-Bibliothekskorruption

Präzise Korruptionsdiagnose

• Dominante Null-Klon-Exposition: Ultra-tiefe NGS (25M Reads) zeigte, dass 95% der Phagen im dritten Eluat identisches nicht-funktionales Peptid WSLGYTG aufwiesen. Die konventionelle Sanger-Sequenzierung (30 Klone) verpasste dieses Signal vollständig.
• Wachstumsvorteilsmechanismus: Die Ganzgenomsequenzierung identifizierte die Deletion des lacZ-Gens, was eine 142-fache Amplifikationseffizienz im Vergleich zu normalen Klonen zur Folge hatte und den Zusammenbruch der Bibliotheks-Homogenisierung vorantrieb.

2. Dynamik des Vielfaltverfalls

• Monoklonaler Zusammenbruch: Die gesunde anfängliche Vielfalt (41% Monoklonalen) verschlechterte sich auf 0,04% in den Eluaten, was auf schwerwiegende Amplifikationsengpässe hinweist.
• Funktionale Sequenzverluste: Einzigartige Sequenzen nahmen um das 770-Fache ab (61,6 % → 0,08 %), was die kompetitive Ausschlusswirkung von hochaffinen Klonen mit niedriger Frequenz durch wachstumsdominante Varianten bestätigt.

3. Analyse des False-Positive-Mechanismus

• Amplifikationsgetriebene Artefakte: WSLGYTG-Klone proliferierten identisch in zielfreien Kontrollen, was bestätigte, dass die Anreicherung aus der Dominanz der Amplifikation (Pr-TUP) und nicht aus der Bindungsfähigkeit resultierte.
• Einschränkungen der Sanger-Sequenzierung: Während Sanger 11 falsch-positive Ergebnisse feststellte, offenbarte NGS ihre tatsächlichen Ranglisten über 1000, was einen 90%igen Stichprobenbias in traditionellen Methoden aufdeckte.

4. Zuschreibung von Screening-Fehlern

• Wiederherstellungsratenillusion: 200-fache Ausgabenerhöhung (1,6×10⁻⁶→3,4×10⁻⁴) über Screening-Runden stellte eine korruptive Klonamplifikation dar, nicht eine echte Zielanreicherung.
• Funktionale Ungültigkeit: SPR und Durchflusszytometrie bestätigten, dass die Kandidatenpeptide (z. B. p16/p18) keine Bindungsaktivität aufwiesen, was die Diagnose einer NGS-Korruption untermauerte.

Technischer Wert und Auswirkungen der Qualitätskontrolle

• NGS ermöglicht:
  • Korruptionsdetektion: Ultra-tiefe Scans (0,08% Sensitivität) → wachstumsdominante Klonverfolgung → Quantifizierung des Diversitätsverfalls
  • Kritische Enthüllungen:

Primäre Screening-Fehler stammen von Bibliothekskorruption, nicht von Zielproblemen oder Entwurfsfehlern.

Die Wiederherstellungsrate ist unzuverlässig; der Anteil der monoklonalen Antikörper (>20%) sollte die Screening-Gesundheit bewerten.

Die Sanger-Sequenzierung führt zu erheblichen Verzerrungen; NGS ist entscheidend für präzises Mining (Sell DK et al., 2024)

Die Häufigkeit der Klone in der naïven Ph.D.TM-7-Bibliothek (oben) und im Eluat der 3. Runde (unten) wird als gestapelte Balkendiagramme dargestellt (Sell DK et al., 2024).

Umfassender Fall 3: Beschleunigung der zielgerichteten Peptidentdeckung durch NGS

1. Qualitätskontrolle beim Bau von Bibliotheken

• Sequenzintegritätsprüfung:
  • Vollständige Antikörpergenabdeckung (1,4 kb) mit Long-Read-NGS (z. B. PacBio)
  • Erkennung von Frameshifts/Stoppcodons
  • Die funktionale Klonrate wurde auf >95% erhöht (im Vergleich zu 70% mit Sanger-Sequenzierung).
• Vielfaltsquantifizierung:
  • Shannon-Index >9,0 (was auf eine Bibliothekskapazität von >10¹⁰ hinweist)
  • Identifizierte Codon-Nutzungsbias (z. B. SER-Design: 33 % → CDR3-Messung: 62 %)
  • Optimierung des Leitfadens zur Syntheseprotokoll

2. Überwachung des Screening-Prozesses

• Korruption Frühwarnung:
  • Echtzeitwarnungen, wenn hochfrequente ungültige Klone (z. B. WSLGYTG) 95 % überschreiten.
  • Verhindert Ressourcenverschwendung (z. B. CD4-zielgerichtetes Screening: 90 % Kosteneinsparungen)
• Funktionale Motivverfolgung:
  • Quantifizierte Zielmotiv-Anreicherung (z.B. Arsen-Bindung QxQ: 0,14 % → 69,23 % über 3 Runden)
  • Bestätigte Screening-Effizienz

3. Tiefes funktionales Klonen-Mining

• Niedrig-Abundanz Hoch-Affinitäts-Rückgewinnung:
  • NGS entdeckte 54% der hochaffinen Antikörper (EC₅₀ <0,1 nM), die konventionell übersehen wurden.
  • Exklusive Identifizierung von neutralisierenden Antikörpern gegen das 229E-Virus
• Germline-Bias-Korrektur:
  • Unerwartete Anreicherung von VH1-69/VK1-39 (44,2%) enthüllt
  • Geleitete rationale CDR-Mutagenese

4. Anleitung zur Affinitätsreifung

• Nicht-gierige Optimierung:
  • ML-Modelle, die auf NGS-Datensätzen trainiert wurden, ermöglichten polyklonale parallele Mutagenese.
  • Entdeckte kryptische Varianten mit hohem Potenzial (100× Affinitätssteigerung)
• Struktur-Aktivitäts-Vorhersage:
  • NanoNet simulierte 10.000 CDR3-Konformationen.
  • Identifizierte 14-aa-Biegungstopologie (>95% Prävalenz)
  • Dreifacher Erfolg bei der Zielgerichteten Ansprache von konkaven Epitopen

Technologischer Durchbruchswert

NGS verwandelt die Qualitätskontrolle von Stichprobenprüfungen zu einer vollständigen Überwachung des gesamten Zyklus durch:

Etablierung neuartiger molekularer QC-Paradigmen für die Entwicklung von nicht behandelbaren Zielen (Bakhshinejad B et al., 2025)

Ein schematischer Überblick über den Phagen-Display-Biopanning-Workflow und die nachgelagerte Validierung (Bakhshinejad B et al., 2025)

Fazit

Die Qualitätskontrolle von NGS verwandelt die Entwicklung von Phagenbibliotheken von einem "Black-Box-Betrieb" in einen datengestützten Feinsteuerungsprozess. Durch das dreischichtige Verifizierungssystem der Sequenzintegrität → Diversität → Funktionalität wird nicht nur das Risiko eines Screening-Fehlers vermieden, sondern es wird auch ein molekulares Blueprint für das rationale Design der nächsten Generation hochaktiver Bibliotheken bereitgestellt. Mit der Integration von Langlesetechnologie und KI-Vorhersagemodellen bewegt sich die Qualitätskontrolle von Bibliotheken in eine voll geschlossene intelligente Ära von "Design-Bau-Verifizierung".

Für weitere Informationen zum Aufbau und zur Nutzung von Phagen-Sequenzdatenbanken verweisen wir auf "Erstellung und Nutzung von Phagen-Genom-Sequenzdatenbanken".

Die Leute fragen auch

Was sind die Einschränkungen der Phagenanzeige?

Die Phagenanzeige kann möglicherweise nicht alle antigen-spezifischen monoklonalen Antikörper (mAbs) in einer bestimmten Antikörperbibliothek zurückgewinnen. Die Paarung von schweren und leichten Ketten spiegelt möglicherweise nicht die der in vivo Immunoglobuline wider.

Was ist Bibliotheks-Panning?

In seiner einfachsten Form wird das Panning durchgeführt, indem eine Bibliothek von phagen-angezeigten Peptiden mit einer Platte (oder einem Bead), die mit dem Ziel beschichtet ist, inkubiert wird, die ungebundenen Phagen abgewaschen werden und die spezifisch gebundenen Phagen eluiert werden.

Was ist Phagen-Biopanning?

Phagenanzeige-Biopanning ist ein wichtiges, weit verbreitetes Werkzeug, um spezifische positive Klone aus großen Antikörperfragmentbibliotheken zu identifizieren und zu isolieren sowie erste Kandidaten durch verschiedene weitere Ingenieurstrategien, wie z.B. bei der Affinitätsreifung, zu entwickeln.

Was ist Phagenkontrolle?

Die Phagentherapie ist eine Art biologischer Kontrolle, bei der Bakteriophagen eingesetzt werden, um mikrobielle Populationen anstelle von antibakteriellen Mitteln zu kontrollieren. Bakteriophagen interagieren mit spezifischen Rezeptoren auf der Wirtsmembran und injizieren dann ihr genetisches Material in Bakterien.

Was sind die Einschränkungen der Phagentypisierung?

Die Phagentypisierung erfordert die Verwendung einer umfassenden Anzahl von Phagen, weshalb sie typischerweise nur in Referenzlaboren eingesetzt wird. Sie basiert auch auf der Interpretation des individuellen Lyse-Musters und dem Vergleich mit einem Standard, was in der Vergangenheit zu widersprüchlichen Ergebnissen aus verschiedenen Laboren geführt hat.

Referenzen:

1. Nannini F, Senicar L, Parekh F, Kong KJ, Kinna A, Bughda R, Sillibourne J, Hu X, Ma B, Bai Y, Ferrari M, Pule MA, Onuoha SC. Kombination von Phagenanzeige mit SMRTbell-Nächste-Generations-Sequenzierung zur schnellen Entdeckung funktioneller scFv-Fragmente. mAbs2021 Jan-Dez;13(1):1864084.
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3. Verkaufen DK, Bakhshinejad B, Sinkjaer AW, Dawoodi IM, Wiinholt MN, Sloth AB, Stavnsbjerg C, Kjaer A. Verwendung von NGS zur Aufdeckung der Korruption einer Peptid-Phagenanzeigeauswahl. Aktuelle Themen in der Molekularbiologie2024 Sep 21;46(9):10590-10605.
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