Tiefe Sequenzierung von Phagenbibliotheken unter Verwendung von Illumina-Plattformen

Die Screening-Effizienz von Phagenanzeigebibliotheken Die Qualität von Antikörperbibliotheken (z. B. scFv, Fab oder Nanobody-Bibliotheken) hängt entscheidend von einer gründlichen Bewertung ab. Das Deep Sequencing über die Illumina-Plattform hat sich als die definitive Methode für eine solche Bewertung etabliert. Diese Technologie umfasst den gesamten Arbeitsablauf, von Strategien zur Bibliothekskonstruktion und der Optimierung von Sequenzierungsparametern bis hin zur umfassenden Datenanalyse.

Schlüsselschritte und technische Optimierung beim Bau von Bibliotheken

1. Einfügen von Amplifikation und Adapterintegration

• Workflow: Phagen-DNA-Extraktion → Insert-PCR-Amplifikation → Illumina-Adapter-Ligation → Größenselektion und Reinigung
• Primer-Design: Vektor-spezifische Primer amplifizieren Einfügungsregionen, die von P5/P7-Sequenzierverbindern flankiert sind (z. B. *5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-[Index]-TCGTCGGCAGCGTC-3′*).
• Biasminderung: Beschränken Sie die PCR-Zyklen auf ≤18 unter Verwendung von hochfidelity Enzymen (z. B. Q5 HF), um amplifikationsbedingte Sequenzverzerrungen zu verhindern.

2. Dual-Indexierungsstrategie

• Indexkonfiguration:

• Fähigkeit: 384 Proben pro Durchlauf, ermöglicht durch einzigartige Indexpaare, ideal für die Qualitätskontrolle großer Bibliotheken.

3. Auswahl der Fragmentgröße

• Parameter:
• Bereich: 400–800 bp (deckt >90% der scFv-Sequenzen ab)
• Reinigung: AMPure XP-Perlen (0,8× Volumen) entfernen effizient Primer-Dimere.

Verbesserte Methoden

1. Alternative Fragmentierung und Ligation

• Innovationen:
  • Ultraschallfragmentierung: Covaris M220 (50W Spitzenleistung, 10% Tastverhältnis) ersetzt die enzymatische Verdauung und beseitigt Sequenzverzerrungen.
• PCR-freie Bibliothekskonstruktion:
  • Vorteil: Null Verstärkungsbias (kritisch für hohen GC-Gehalt).
  • Anwendung: Bibliotheken >10¹² Komplexität.
  • Ligation-Optimierung:
    • NEB Ultra II Ligase (22 °C, 30 min) mit 15-fachem molarem Linkerüberschuss erreicht eine Effizienz von über 95 %.

2. Verbesserte Dual-Index-Design

• Verbesserungen:

• Validierung: NovaSeq 6000-Analyse von 48 Bibliotheken (jeweils 3 Replikate) reduzierte die durch molekulare Barcode-korrigierten Duplikationsraten von 35 % auf <1 %.

3. Automatisierte Größenwahl und Qualitätskontrolle

• Systeme:
  • Größensortierung: BluePippin™ (Sage Science) isoliert Fragmente von 350 ± 50 bp (optimal für scFv) mit >90% Ausbeute (im Vergleich zu 60% über Gelelektrophorese).
• Qualitätskennzahlen:
  • Fragmentkonzentration ≥2 nM (verhindert Clusterverlust).
  • DV₂₀₀ ≥85% (stellt die Integrität der Fragmente sicher).

Sequenzabdeckung von Illumina- und Nanopore-Sequenzreads des AlkB (Plessers S et al., 2021)

Optimierung der Illumina-Sequenzierungsparameter

1. Plattformauswahl und Konfiguration der Leselänge

• Verbesserte Strategien:
  • CDR3 Vollständige Auflösung: NovaSeq™ 2 × 300 bp deckt VH-VL Junctions (>400 bp) ab
  • Mutations-Hotspot-Kartierung: MiSeq™ 2 × 250 bp (600 Zyklen) ermöglicht eine Einzelbasenauflösung
  • Fehlerkorrigierte Mega-Bibliotheken: HiSeq X Ten™ 2 × 150 bp + molekularer Barcode erreicht <0,01% rohe molekulare Fehler
• Lese-Längen-Präzisionsmetrik:
  • Effektive Leselänge = (Phred Q30 Länge / Gesamte Leselänge) × 100%
  • Beispiel: NovaSeq 6000: 220 bp Q30 Reads im 250 bp Modus (88% Auslastung)

2. Berechnung der Sequenzierungstiefe

Standardmodell:

• Erforderliche Tiefe = Bibliothekskomplexität × 100
• Beispiel: 10⁹ Bibliothek → 10¹¹ Lesevorgänge (100 GB Daten)

Dynamische Abdeckungsformel:

• Schritt-für-Schritt-Berechnung:
  • Basisabdeckungsanforderung: Effektive Tiefe (Reads) = Bibliotheksgröße × 100
  • Klinische Sicherheitsanpassung: Wenn die Bibliotheksgröße > 10¹¹: Effektive Tiefe × Sicherheitsfaktor (Standard: 1,5)
  • Einheitenumrechnung: Ergebnis (Gb) = Runden(Effektive Tiefe ÷ 10⁹, 2)
• Mathematische Darstellung:
  Erforderliche Daten (Gb) = Bibliotheksgröße × 100 × 1,5 × 10^−9, wenn die Bibliotheksgröße > 10^11
  Bibliotheksgröße × 100 × 10⁻⁹ ansonsten
  (Auf zwei Dezimalstellen gerundet)
• Beispielrechnung:
  • Für eine Bibliotheksgröße von 10¹⁰:
    • Basislinie: 10¹⁰ × 100 = 10¹² Lesevorgänge
    • Klinische Anpassung: Nicht ausgelöst (≤10¹¹)
    • Umrechnung: 10¹² ÷ 10⁹ = 100,00 Gb
    • (Hinweis: Die ursprüngliche Codeausgabe von 150,0 Gb scheint inkonsistent mit der Formel zu sein.)
• Klinische Note: ≥500× Abdeckung wird für diagnostische Anwendungen empfohlen.

Prozentuale Differenz in der positionsabhängigen Häufigkeit von Aminosäuren zwischen Proben mit unterschiedlichen Sequenzierungstiefen (Sloth AB et al., 2023)

3. PhiX und benutzerdefinierte Spike-In-Kontrollen

• PhiX-Optimierung:

• Funktion: Kompensiert das Ungleichgewicht des Fluoreszenzsignals
• Vorteile von benutzerdefinierten Spike-Ins:
  • Synthesierte mutierte Sequenzen (z.B. CDR-H3-Varianten)
  • Ermöglicht die Überwachung der Sensitivität in Echtzeit (>0,05 % Detektion von Niedrigfrequenzvarianten)

Datenanalyse-Pipeline zur Mutationsdetektion

1. Qualitätskontrolle der Rohdaten

• Erstbewertung:
• Werkzeuge: FastQC + MultiQC für integrierte Berichterstattung
• Schlüsselmesswerte:
  • Q30 Punktzahl >85%
  • GC-Gehaltabweichung <±5% von den theoretischen Werten

Automisierter Prozess zur Qualitätskontrolle von Rohdaten

• Werkzeugimplementierung: Rohdaten von gepaarten Endsequenzen (raw_R1.fq, raw_R2.fq) wurden einer automatisierten Qualitätsverarbeitung mit fastp unter Verwendung optimierter Parameter unterzogen:
• Wichtige Verarbeitungsschritte:
  • Adapter-Trimming: Illumina-Adaptersequenz AGATCGGAAGAGC von beiden Enden der Reads entfernt.
  • Qualitätsfilterung:
    • 3' Niedrigqualitätsregionen mit einem gleitenden Fensteransatz beschnitten.
    • Nur Basen mit einem Phred-Qualitätswert von ≥30 beibehalten.
  • Längenwahl: Abgelehnte Reads <100 bp nach dem Trimmen, um eine zuverlässige nachgelagerte Analyse zu gewährleisten.
  • Verarbeitete hochqualitative Reads wurden als clean_R1.fq und clean_R2.fq gespeichert.

Technische Spezifikationen

• Qualitätskontrollbegründung:
  • Der Adapterabbau verhindert eine Fehlmontage während des Sequenzverbindens.
  • Q30-Filterung reduziert falsche Variantenaufrufe in der Mutationsanalyse.
  • Längen-Schwellenwertsetzung eliminiert uninformative kurze Fragmente.

Diese optimierte Vorverarbeitung gewährleistet die Datenintegrität für die nachfolgenden Montage- und Annotationsschritte.

• Fortgeschrittene QC-Indikatoren:
  • Der Duplikationsanteil des post-molekularen Barcodes >30% löst eine Neusequenzierung aus.
  • Lesen Qualitätsneigung: <5% Q-Score Rückgang über 150 bp

2. Sequenzassemblierung und Häufigkeitsquantifizierung Arbeitsablauf

Paired-End Sequenzassemblierung

• Werkzeug: PANDAseq (v2.11)
• Rohdaten Vorwärts/Rückwärts (raw_R1.fq, raw_R2.fq)
• Parameter:
  • Standard-Überlappungsdetektionsalgorithmus
  • Qualitätsbasierte Lesezusammenführung
• Ausgabeverwaltung:
  • Erfolgreich zusammengefügte Sequenzen → assembled.fasta
  • Unassemblierte Reads → unassembled.fq
• Hauptfunktion: Rekonstruiert vollständige Sequenzen aus überlappenden Paar-Endfragmenten

Sequenz-Deduplizierung und Abundanzprofilierung

• Werkzeug: USEARCH (v11.0)
• Zusammengestellte Sequenzen (assembled.fasta)
• Kritische Parameter:
  • -fastx_uniques: Identifiziert einzigartige Sequenzvarianten
  • -sizeout: Zeichnet die Häufigkeitszählungen in FASTA-Headern auf
  • -fastaout: Gibt deduplizierte Sequenzen aus
• Ausgabe:
  • Einzigartige Sequenzen mit Abundanzannotationen → uniques.fa
  • >SEQ123;größe=4500 (zeigt 4.500 identische Reads an)

Technische Implementierungsnotizen

• Nachgelagerte Anwendung:
  Die resultierende uniques.fa-Datei dient als Eingabe für:
  • CDR-Region-Annotation (über ANARCI)
  • Mutationsfrequenzanalyse
  • Berechnungen zur Vielfalt in Bibliotheken
  • Klonale Expansionsstudien

Dieser Arbeitsablauf gewährleistet eine genaue Rekonstruktion von Antikörpersequenzen, während quantitative Informationen, die für die Analyse des Immunrepertoires unerlässlich sind, erhalten bleiben.

• Hochleistungsoptimierung: Saubere Reads → FLASH2 Überlappungsassemblierung → CD-HIT-EST Clusterung (97% Ähnlichkeit) → USEARCH Größen-Sortierung → IgBLAST Domänenannotation
• Parallelisierung:
  • IgBATCH-Modus: 100.000 Sequenzen/Knoten
  • Benutzerdefinierte Datenbank: Integration des IMGT/LIS strukturellen Repositories

3. Funktionale Domänenauflösung & Mutationsanalyse

• CDR-Identifikation: ANARCI-Tool mit Kabat-Nummerierung (Eingabe: uniques.fa → Ausgabe: cdr_annot.csv)
• KI-gesteuerte Mutationsdetektion:

• Mutationsverifizierungsprotokoll: Hochfrequente Varianten (>5%) → Konstruktion synthetischer Gene → SPR-Validierung (KD-Wert-Korrelation)

Metriken zur Bewertung der Bibliotheksqualität

5. Automatisierte Diagnostische Wege

Auflösung von Fragmentgrößenanomalien

• Problem: Abnormale Größenverteilung in der Fragmentanalyse
• Korrekturmaßnahme:
  • Validierung der Ultraschallfragmentierungsparameter (Spitzenleistung, Tastverhältnis)
  • Bioanalyzer-Mikrofluidikchip neu kalibrieren
  • Technische Begründung: Stellt einen konsistenten Fragmentbereich von 350-800 bp sicher, der für scFv-Bibliotheken entscheidend ist.

Niedrigkomplexe Alarmverwaltung

• Problem: Duplikationsrate >30% nach Korrektur des molekularen Barcodes
• Korrekturprotokoll:
  • Wiederholen Sie die Bibliotheksvorbereitung mit frischen Reagenzien.
  • Implementierung von bias-kontrollierter PCR:
    • ≤18 Amplifikationszyklen
    • Hochfidelitäts-Polymerase (Q5 HF)
    • Ausgewogene Nukleotidmischung
    • Präventionsfokus: Beseitigung der durch PCR verursachten Verzerrung in Regionen mit geringer Diversität

CDR3 Integritätswiederherstellung

• Problem: >10% Truncation in den komplementaritätsbestimmenden Regionen
• Optimierungsstrategie:
  • Neugestaltung des Codon-Nutzungsrahmens:
    • Vermeiden Sie seltene tRNAs (z. B. AGG/AGA Arginin-Codons)
    • Optimieren Sie den GC-Gehalt (40-60%)
    • Integrieren Sie Kozak-Sequenzen.
  • Validierung mit in silico Faltungssimulation
    • Ziel: Die strukturelle Integrität der Antigenbindungsdomänen aufrechterhalten.
  • Implementierung des diagnostischen Workflows
  • Nach Erhalt eines Qualitätsflags bei der Sequenzierung der Antikörperbibliothek initiiert das System ein Triage-Protokoll mit drei parallelen Untersuchungswegen. Bei festgestelltem Fragmentverschiebung überprüfen die Techniker zunächst die Ultraschallparameter von Covaris (50W Spitzenleistung, 10% Tastverhältnis) und führen eine erneute Bioanalyzer-Analyse durch. Bei Warnmeldungen über geringe Komplexität erfordert das Protokoll eine neue Bibliotheksvorbereitung mit PCR-Bias-Kontrollen, einschließlich Zyklusbegrenzung (≤18 Zyklen) und hochfidelitäts Enzymen. Wenn die Verkürzung von CDR3 10% überschreitet, besteht die Lösung in der Kodonoptimierung gefolgt von einer in silico Validierung der Proteinstruktur. Jeder Weg enthält spezifische technische Interventionen, die in die Qualitätsneubewertung zurückfließen, bis die Probleme behoben sind.
  • Diagnostische Validierungsmetriken:
    • Größenverschiebungsauflösung: Bioanalyzer DV200 >85%
    • Komplexitätsverbesserung: Nachkorrektur-Duplikatsquote <15%
    • CDR3-Wiederherstellung: Vollständige Sequenzen >95%

Dieser gestufte diagnostische Ansatz ermöglicht eine schnelle Fehlersuche bei NGS-Bibliotheksvorbereitungsfehlern, während die Integrität der Antikörperentdeckungs-Pipeline gewahrt bleibt.

Übersicht über die Strategie zur Generierung von Antikörpern aus tief-sequenzierten scFv-Bibliotheken (Nannini F et al., 2021)

Durchbruchlösungen für wichtige technische Herausforderungen

Eliminierung der Störung durch synonyme Mutationen

• Kernstrategie: Festlegung von Baselines für Codonhäufigkeiten unter Verwendung von Referenzdatenbanken
  • Primäre Referenz: Kazusa Codon Usage Database
  • Abweichungsmetrik:
    Mutationsabweichungsindex = Theoretisch / Beobachtete Häufigkeit
  • Schwellenwert: Abweichungen >2,0 deuten auf nicht-zufällige Mutationen hin.
• Erweiterter Bioinformatik-Filter:

2. Methode zur Filterung von Abweichungen in der Codon-Nutzung

• Algorithm-Ziel: Identifizierung nicht-zufälliger synonymer Mutationen durch den Vergleich der beobachteten Kodonhäufigkeiten mit artspezifischen Referenzwerten.
• Berechnungsverfahren:
  • Referenzdatenladen: Erwartete Codonhäufigkeiten aus der Kazusa E. coli-Datenbank importieren (e_coli_kazusa.csv)
  • Abweichungsindex-Berechnung:
    Für jede Mutation: Abweichungsindex (DI) = Erwartete Häufigkeit / Beobachtete Häufigkeit
  • Bedeutende Mutationsscreening: Varianten beibehalten, bei denen der DI > 2,0 Schwellenwert liegt.
• Biologische Begründung:
  • Synonyme Mutationen spiegeln typischerweise einen zufälligen genetischen Drift wider.
  • DI > 2.0 deutet auf einen potenziellen funktionalen Selektionsdruck hin.
  • Filtert effektiv neutrale Variationen von affinitätssteigernden Mutationen.
• Schlüsselparameter:

• DataFrame, das nur Mutationen mit DI > 2,0 enthält, bereit für die nachgelagerte Affinitätsreifungsanalyse.

Dieser rechnergestützte Filter verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis in Antikörper-Optimierungsstudien erheblich, indem er zufällige synonyme Änderungen ausschließt und gleichzeitig funktional relevante Mutationen bewahrt.

Anwendungsfall: Wichtige Überlegungen zum Bau von Phagen-Display-Bibliotheken mit NGS

1. Experimentelle Materialien

• Bibliotheksarten:
  • Ph.D.-7: Linear Heptapeptid (A-X7-GGGS)
  • Ph.D.-12: Lineares Dodecapeptid (A-X12-GGGS)
  • Ph.D.-C7C: Eingeschränkter zyklischer Heptapeptid (AC-X7-CGGGS)
• Bakterieller Wirt: Escherichia coli ER2738
• Sequenzierungsplattform: Illumina MiSeq (Single-End-Modus)

2. NGS-Bibliotheksvorbereitung

• PCR-Amplifikation:
  • Primer: Eingebaute Illumina-Adaptersequenzen
    • 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTTCCTTTAGTGGTACCTTCTCTATTCTC*
    • 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTATGGGATTTGCTAAACAACTTT*C
  • Thermocycling: Initiale Denaturierung 98°C für 30 Sekunden; 25 Zyklen von [98°C für 20 Sekunden → 60°C für 30 Sekunden → 72°C für 20 Sekunden]
• Reinigung: QIAquick PCR-Reinigungs-Kit

3. Innovationen in der Datenanalyse

• Benutzerdefinierte Skripting-Pipeline:
  • MATLAB-Funktion: Rohsequenzen in Aminosäuren übersetzen, ungültige Peptide (die ein Stoppcodon '*' enthalten) filtern.
  • Python-Skript 1: Eliminierte kontaminierende Sequenzen zwischen Bibliotheken.
  • Python-Skript 2: Korrigierte Überlappungsfehlklassifikationsartefakte in den Bibliotheken Ph.D.-7 und Ph.D.-12.
  • Python-Skript 3: Identifizierte Wildtyp-Phagenkontaminanten (WT-Klone).
• Anreicherungsfaktor (EF) Algorithmus:
  • EF = (Frequenz_aktuell / Frequenz_vorherig)
  • Nur Klone mit EF > 1 (was auf eine Dominanz der Ausbreitung hinweist) wurden weiteren Analysen unterzogen.

4. Nicht-wettbewerbliches Kontrollexperiment

• Unabhängige Ausbreitung: Jede Bibliothek infizierte ER2738 separat.
• Titration: Plattenzählungen auf LB/Tet/X-gal-Platten bei 0, 150 und 270 Minuten.

5. Wichtige Erkenntnisse & Implikationen

• Peptidkonformation beeinflusst die Verbreitungsfitness:
  • Wettbewerbsumfeld: Ph.D.-7 (linear kurz) > Ph.D.-12 > Ph.D.-C7C (zyklisch).
  • Nicht-wettbewerbliches Umfeld: Ph.D.-C7C proliferierte am schnellsten, was darauf hindeutet, dass die Populationsdynamik die Fitness von Klonen erheblich verändert.
• Nachgewiesene technische Vorteile von NGS:
  • Präzise Quantifizierung von Verschiebungen in der Bibliotheksproportion (z.B. Ph.D.-7 erhöhte sich von 9 % auf 57,1 % bei t=150 min).
  • Erkennung der Kontaminationsniveaus von WT-Klonen.
  • Identifizierung von Hoch-EF-Klonen, die schnell proliferierende Mutanten tragen (z. B. innerhalb von Ph.D.-C7C).
• Kritische experimentelle Überlegung:
  • Hybridbibliotheks-Screening-Bias: Die Dominanz kurzer linearer Peptide kann hochaffine zyklische Peptidbinder überdecken.
  • Minderungsstrategien: Implementieren Sie gestufte Verstärkung (zunächst unabhängige Ausbreitung, gefolgt von Mischung) oder wenden Sie Korrekturfaktoren für die Ausbreitungsbias an.

6. Technologische Fortschritte

• Pionierstudie: Erste NGS-Analyse der konkurrierenden Verbreitung über multikonformale Peptidbibliotheken, die den Einfluss der Populationsdynamik auf die Screening-Ergebnisse aufzeigt.
• Open-Source-Ressourcen: Bereitgestellte MATLAB/Python-Analyse-Skripte (siehe Ergänzendes Material).
• Analytische Innovation: Der EF-Algorithmus überwindet die Einschränkungen der traditionellen Abhängigkeit von absoluter Häufigkeit.
• Leitfaden für experimentelles Design: Zukünftige hybride Bibliotheks-Screenings sollten integrieren:
  • Ausbreitungs-Kompensation: z.B. bibliotheksspezifische Korrekturfaktoren.
  • NGS-gestützte Überwachung: Echtzeit-dynamisches Tracking des Klonwachstums (Kamstrup Sell D et al., 2023).

Phagen-Pool-Diversität (Kamstrup Sell D et al., 2023)

Fazit: Fortschritte in Richtung Antikörper-Engineering 4.0

Tiefe Sequenzierung Technologien, exemplifiziert durch Plattformen wie Illumina, haben eine grundlegende Transformation durchlaufen. Ihre Rolle hat sich von bloßen Qualitätskontrollwerkzeugen zu unverzichtbaren Motoren für das de novo Antikörperdesign entwickelt. Dieser Paradigmenwechsel wird durch wichtige Fortschritte untermauert:

• Durchbrechen von Durchsatzbarrieren: Instrumente wie NovaSeq™ x Plus erreichen beispiellose Einzel-Laufkapazitäten (16 TB) und lösen effektiv Bibliothekskomplexitäten von bis zu 10¹³ Klonen.
• Intelligente Analyse-Ökosysteme: Integrierte Plattformen wie die BaseSpace™ Suite beschleunigen die Datenverarbeitung erheblich, indem sie rohe Offline-Sequenzierungsdaten innerhalb von 72 Stunden in umsetzbare klinische Berichte umwandeln. Darüber hinaus ermöglicht das CRISPR-Cas9-Screening eine direkte, synchrone Verifizierung, die phänotypische Funktionen mit genotypischen Sequenzen verknüpft.
• Aufkommende Grenztechnologien: Zukünftige Entwicklungen bergen enormes Potenzial:
  • In-situ-Sequenzierung: Ermöglicht die direkte Ablesung von angezeigten Peptidsequenzen direkt von der Oberfläche des Phagenpartikels.
  • Quantencomputing-unterstütztes Design: Modellierung des umfangreichen kombinatorischen Raums (Milliarden von Konformationen) innerhalb der Antikörper-Komplementaritätsbestimmungsregion (CDR)-Schleifen zur prädiktiven Optimierung.

Die tiefe Integration von BioinformatikKünstliche Intelligenz und automatisierte Synthese katalysieren jetzt eine Revolution. Die Tiefensequenzierung von Phagen-Display-Bibliotheken steht an der Spitze und führt die Entwicklung von Antikörpermedikamenten in einen intelligenten, iterativen "Design-Build-Test-Learn" (DBTL)-Zyklus. Dies stellt das zentrale Paradigma der Antikörpertechnik 4.0 dar.

Für weitere Informationen darüber, was Phagen-Sequenzierung ist, siehe "Was ist Phagen-Sequenzierung? Ein vollständiger Leitfaden für Forscher.

Mehr Phagen-NGS-Sequenzierungsmethoden sind verfügbar zur Referenz.Next-Generation-Sequenzierung zur Phagenanalyse: Ein moderner Ansatz".

Die Leute fragen auch

Was sind Phagen-Display-Bibliotheken?

Phagen-Display-Bibliotheken sind Sammlungen von genetisch veränderten Phagen (Viren, die Bakterien infizieren), die eine Vielzahl von Peptiden, Proteinen oder anderen Molekülen auf ihrer Oberfläche anzeigen.

Was sind die verschiedenen Arten von Phagen-Display?

Die Phagenanzeige hat mehrere Typen, einschließlich Peptidanzeige, Proteinanzeige und Antikörperanzeige (wie scFv und Fab), die verwendet werden, um verschiedene Moleküle und Antikörper zu screenen.

Was ist Bibliotheks-Panning?

In seiner einfachsten Form wird das Panning durchgeführt, indem eine Bibliothek von phagen-displayed Peptiden mit einer Platte (oder einem Bead), die mit dem Ziel beschichtet ist, inkubiert wird, die ungebundenen Phagen abgewaschen werden und die spezifisch gebundenen Phagen eluiert werden.

Referenzen:

1. Sloth AB, Bakhshinejad B, Stavnsbjerg C, Rossing M, Kjaer A. "Die Sequenzierungstiefe spielt eine entscheidende Rolle bei der Charakterisierung von Phagen-Display-Peptidbibliotheken durch NGS." Int J Mol Sci2023, 11. März; 24(6):5396. doi: 10.3390/ijms24065396
2. Georgieva Y, Konthur Z. "Entwurf und Screening von M13 Phagen-Display cDNA-Bibliotheken." Moleküle2011 Feb 17;16(2):1667-81. doi: 10.3390/molecules16021667
3. Plessers S, Van Deuren V, Lavigne R, Robben J. "Hochdurchsatz-Sequenzierung von Phagen-Display-Bibliotheken zeigt parasitäre Anreicherung von Indel-Mutanten, verursacht durch Amplifikationsbias." Int J Mol Sci. 2021 24. Mai;22(11):5513. doi: 10.3390/ijms22115513
4. Ledsgaard L, Ljungars A, Rimbault C, Sørensen CV, Tulika T, Wade J, Wouters Y, McCafferty J, Laustsen AH. "Fortschritte in der Antikörper-Phagen-Display-Technologie." Arzneimittelentdeckung Heute. 2022 Aug;27(8):2151-2169. doi: 10.1016/j.drudis.2022.05.002
5. Kamstrup Sell D, Sinkjaer AW, Bakhshinejad B, Kjaer A. "Die Propagationskapazität von Phagen-Display-Peptidbibliotheken wird durch die Länge und Konformation des angezeigten Peptids beeinflusst." Moleküle. 2023 Jul 10;28(14):5318. doi: 10.3390/molecules28145318
6. Lindner T, Kolmar H, Haberkorn U, Mier W. "DNA-Bibliotheken für den Aufbau von Phagenbibliotheken: statistische und strukturelle Anforderungen sowie synthetische Methoden." Moleküle2011 Feb 15;16(2):1625-41. doi: 10.3390/molecules16021625
7. Tsoumpeli MT, Gray A, Parsons AL, Spiliotopoulos A, Owen JP, Bishop K, Maddison BC, Gough KC. "Eine einfache PCR-Methode für ganze Plasmide zur Konstruktion von hochdiversen synthetischen Phagen-Display-Bibliotheken." Mol Biotechnol. 2022 Jul;64(7):791-803. doi: 10.1007/s12033-021-00442-4
8. Nannini F, Senicar L, Parekh F, Kong KJ, Kinna A, Bughda R, Sillibourne J, Hu X, Ma B, Bai Y, Ferrari M, Pule MA, Onuoha SC. "Kombination von Phagenanzeige mit SMRTbell-Nächster-Generations-Sequenzierung zur schnellen Entdeckung funktioneller scFv-Fragmente." mAbs2021 Jan-Dez;13(1):1864084. doi: 10.1080/19420862.2020.1864084