Probenvorbereitung für hochwertige Sequenzierungsergebnisse

Warum die Probenqualität den Sequenzierungserfolg bestimmt

In der Welt der Next-Generation-Sequenzierung (NGS) ist die Qualität Ihrer Eingabemuster oft der entscheidendste Faktor für den Erfolg oder Misserfolg. Selbst mit dem fortschrittlichsten Sequenzierer und dem besten Bibliotheksvorbereitungskit können degradierte, unreine oder niedrig ausbeutende DNA/RNA einen gesamten Lauf gefährden.

Wichtige Gründe, warum die Qualität von Proben wichtig ist

Die enzymatische Effizienz hängt von der Reinheit ab.

Die Schritte der Bibliotheksvorbereitung – Endreparatur, Adapterligatur und PCR-Amplifikation – werden durch Enzyme gesteuert. Verunreinigungen wie Phenol, Salze oder verbleibender Ethanol hemmen diese Enzyme.

2. Die Fragmentintegrität beeinflusst den Sequenzierungsausstoß.

Hochgradig fragmentierte oder beschädigte DNA führt zu ineffizienter Cluster-Generierung oder schlechterer Read-Zuordnung. In aus Gewebe gewonnenen Proben ist eine geringere DNA-Integrität mit signifikant niedrigeren Erfolgsraten verbunden. (Kuwata et al.; NCI SCRUM-Japan-Daten)

3. Quantifizierungsfehler breiten sich stromabwärts aus.

Ungenaue Messungen der DNA-Konzentration führen zu Unterladung oder Überladung des Sequenzers. Überladung verringert die Clusterqualität; Unterladung verschwendet Kapazität. Fluorometrische Assays (Qubit, PicoGreen) werden der Spektrophotometrie für eine präzise Quantifizierung von Nukleinsäuren vorgezogen.

Niedrige Eingaben erhöhen die Empfindlichkeit gegenüber Kontamination.

In Proben mit spärlicher DNA können selbst geringste Mengen an exogener DNA (z. B. aus Reagenzien oder der Umwelt) die Ergebnisse verfälschen. Studien zu nicht kartierten Reads haben gezeigt, dass verdünnte Proben besonders anfällig für Kontaminationsartefakte sind. (Lusk, 2014)

Einfluss: Integrität sagt Erfolg voraus

In einer umfassenden Analyse von formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Geweben (n = 2.573) wiesen Proben mit hohe DNA-Integrität (ΔCt < 4,4 nach qPCR-Metrik) ergab NGS-Erfolgsraten von ~94%. Im Gegensatz dazu hatten Proben mit niedriger Integrität Erfolgsraten von ~5,6%. (Kuwata et al.)

Dieses Ergebnis unterstreicht einen zentralen Punkt: Kein nachgelagerter "Rettungsversuch" kann schlechtes Ausgangsmaterial vollständig kompensieren. In dem Moment, in dem Sie die Probenqualität beeinträchtigen, verringern Sie Ihren Spielraum für Fehler in jedem nachfolgenden Schritt.

Wesentliche Schritte in der Sequenzierung der Probenvorbereitung

Um rohes biologisches Material zuverlässig in sequenzierbereite Nukleinsäuren umzuwandeln, müssen Labore einem disziplinierten, schrittweisen Arbeitsablauf folgen. Im Folgenden finden Sie eine verfeinerte Roadmap sowie Hinweise und bewährte Praktiken.

2.1 Probenentnahme & Stabilisierung

• Wählen Sie Sammlungstuben oder Konservierungsmittel, die Nukleasen oder das Wachstum von Mikroben hemmen (z. B. EDTA für Blut, RNAlater für RNA).
• Minimieren Sie die Anzahl der Frost-Tau-Zyklen – jeder Zyklus degradiert Nukleinsäuren schrittweise.
• Probenmetadaten (Quelle, Zeit, Temperaturverlauf) aufzeichnen, um später anomale Variabilität zu kennzeichnen.

Warum es wichtig ist: Schlechte Handhabung in dieser Phase verstärkt nachgelagerte Artefakte wie Fragmentierung, Kontamination oder Verlust.

2.2 DNA / RNA Extraktion

Dieser zentrale Schritt isoliert Nukleinsäuren aus Zellen, Geweben oder Flüssigkeiten. Die Wahl der Methode (säulenbasiert, magnetische Perlen, Phenol/Chloroform oder automatisierte Systeme) hängt von der Probenart, dem Durchsatz und den Reinheitsanforderungen ab.

Wichtige Überlegungen und bewährte Praktiken:

• Verwenden Sie nukleasefreie, zertifizierte Reagenzien und Verbrauchsmaterialien (Spitzen, Röhrchen, Pipettenspitzen mit Filter).
• Nach der Lyse sicherstellen, dass Proteine, Salze, Detergenzien, Phenol und verbleibender Ethanol vollständig entfernt werden. Illumina warnt, dass verbleibende Inhibitoren (z. B. Phenol, EDTA, Huminsäuren) die Endreparatur, Ligation oder PCR beeinträchtigen können.
• Für einige anspruchsvolle Matrizen (z. B. Pflanzen, Boden, FFPE) ziehen Sie einen zusätzlichen Reinigungs- oder Aufreinigungsschritt (z. B. Spin-Column-Reinigung) in Betracht, um Inhibitoren zu entfernen.
• Wählen Sie einen Elutionspuffer, der mit nachfolgenden Schritten kompatibel ist (z. B. 10 mM Tris, pH 7,5–8,5). Illumina empfiehlt, hohe EDTA- oder saure Puffer zu vermeiden, da diese die Enzymaktivität verringern können.
• Für Hochdurchsatz-Workflows bieten automatisierte Plattformen auf Basis von magnetischen Perlen (z. B. Thermo Fisher KingFisher-Systeme) Konsistenz und reduzierte manuelle Fehler.

2.3 Quantifizierung & Qualitätskontrolle (QC)

Überprüfen Sie nach der Extraktion die Intensität, Reinheit und Integrität Ihrer Nukleinsäure, bevor Sie fortfahren.

Kritische Überprüfungen, die durchgeführt werden sollten:

• Reinheitsverhältnisse (A260/280, A260/230): Die grundlegende UV-Spektrophotometrie zeigt eine Kontamination mit Proteinen, Phenol oder Salz. Akzeptable Bereiche: A260/280 ~1,8 für DNA, ~2,0 für RNA; A260/230 idealerweise > 1,8. Illumina empfiehlt diese als erste Überprüfung.
• Fluorometrische Quantifizierung (Qubit, PicoGreen): Genauer für die Quantifizierung von doppelsträngiger Nukleinsäure. Der DNA Prep-Leitfaden von Illumina warnt ausdrücklich davor, sich ausschließlich auf UV-Methoden zu verlassen.
• Integritäts-/Fragmentierungsbewertung:
• – Gel-Elektrophorese oder TapeStation / Bioanalyzer-Diagramme (für DNA)
• – RNA-Integritätszahl (RIN) oder gleichwertige Metriken für RNA
• Optionale QC-Tests:
• – Kleine "Test"-PCR-Amplifikation zur Detektion von Inhibitoren
• – Spike-in-Kontrolle oder synthetischer Standard zur Überwachung von Ertragsverzerrungen
• Dokumentieren Sie alle QC-Metriken in Ihrem Laborbuch oder LIMS-System, um später Fehlerdiagnosen zu erleichtern.

2.4 Lagerung und Transport von Nukleinsäureproben

Die Erhaltung der Probenintegrität nach der Extraktion ist ebenso wichtig wie die Extraktion selbst.

Richtlinien für Lagerung und Versand:

• Kurzfristig: Lagern Sie Aliquots bei 4 °C, wenn die Verarbeitung innerhalb von Stunden erfolgt; andernfalls bei –20 °C.
• Langfristig: Bei –80 °C lagern (insbesondere für RNA).
• Puffer Verwenden Sie TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA) bei pH 7,5 für DNA; vermeiden Sie zweiwertige Kationen oder Puffer, die den Abbau fördern.
• Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen: Aliquotieren Sie Proben in kleinere Volumina.
• Kühlkette während des Versands: Verwenden Sie Trockeneis oder validierte Transportboxen, um die Temperatur aufrechtzuerhalten. Protokollieren Sie die Temperatur mit Datenloggern.
• Beschriftung & Metadaten: Fügen Sie Identifikatoren, Konzentration, Qualitätskontrollmetriken und Handhabungshistorie hinzu.

Wie man die DNA-Qualität für NGS verbessert

Selbst ein gut gestaltetes Extraktionsprotokoll kann suboptimale DNA liefern, wenn kleinere Details vernachlässigt werden. Im Folgenden finden Sie verfeinerte Taktiken und bewährte Verfahren, um die Qualität Ihrer Probe nahe an ideale Werte für das Sequenzieren zu bringen.

3.1 Hochwertige Ausgangsmaterialien verwenden

• Wann immer möglich, beginnen Sie mit frisch entnommenem oder schockgefrostetem Gewebe. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen degradiert die DNA im Laufe der Zeit.
• Für herausfordernde Proben (z. B. FFPE, alte Archivproben) sollten Sie in Betracht ziehen, kürzere Amplicons zu verwenden oder Hybrid-Capture anstelle von Whole-Genome-Sequenzierung zu nutzen.
• In vergleichenden Studien zeigen Extraktionsmethoden eine Variation von ≥10% in Ertrag und Fragmentgröße, abhängig von Zelltyp und Lyseprotokoll (ScienceDirect, Artikel "Bewertung der DNA-Qualität").

3.2 Optimierung der Lyse- und Bindungsbedingungen

• Passen Sie die Pufferzusammensetzung an (z. B. durch Verwendung ausreichender Detergenzien, Proteinase K und optimaler Salzkonzentrationen), um Zellwände, Membranen und Proteinkomplexe vollständig abzubauen.
• Für Proben mit hohem Gehalt an Polysacchariden oder Phenolen (z. B. Pflanzen, Boden) zusätzliche Reinigungsschritte oder Bindepufferzusätze (z. B. PVPP, CTAB oder Inhibitorenentfernungssäulen) einbeziehen.
• Verwenden Sie sanftes Mischen (z. B. langsame Rotation) anstelle von Vortexen, um mechanisches Scheren von genomischer DNA zu vermeiden.
• Halten Sie die Inkubationszeiten gerade lange genug für eine vollständige Lyse; eine Überinkubation unter harten Bedingungen kann die DNA-Enden beschädigen.

3.3 Vermeidung von Hemmstoffen und Übertragungscontaminanten

• Nach den Bindungs- und Waschschritten entfernen Sie vorsichtig den verbleibenden Ethanol – trocknen Sie das Pellet nicht zu stark, da dies die Wiederauflösung ineffizient machen kann.
• Verwenden Sie einen zusätzlichen Waschschritt (z. B. 70 % Ethanol) oder einen Schritt mit "Waschpuffer + 80 % Ethanol", wenn Sie es mit klebrigen Verunreinigungen zu tun haben.
• Fügen Sie, falls erforderlich, einen RNAse- oder DNase-Reinigungsschritt (je nach Ziel) hinzu, um unerwünschte Nukleinsäurearten zu entfernen.
• Verwenden Sie einen abschließenden Spin- oder Vakuumschritt, um verbleibende Salze oder Reagenzien (z. B. Guanidin, EDTA) zu entfernen, die downstream Enzyme hemmen könnten.

3.4 Sanfte Elutionsstrategien

• Erwärmen Sie die Elutionspufferlösung (z. B. 37 °C), bevor Sie sie auf die Säule oder die Perlen auftragen; lassen Sie sie 2–3 Minuten auf der Matrix inkubieren, bevor Sie zentrifugieren.
• Eluieren Sie in einem Puffer mit niedrigem Salzgehalt (z. B. 10 mM Tris, pH 7,5) oder in nucleasefreiem Wasser (wenn akzeptabel) anstelle von Puffern, die zu viel EDTA enthalten.
• Verwenden Sie Elutionsvolumina, die gerade ausreichend für die Konzentration sind, ohne den Ertrag zu opfern. Für einige Benutzer führen zwei aufeinanderfolgende Elutionen mit kleinem Volumen zu einer besseren Konzentration und Rückgewinnung.

3.5 Automatisierung nutzen und Verbrauchsmaterialien reinigen

• Automatisierte Plattformen (z. B. magnetische Perlenroboter) reduzieren menschliche Fehler und Variationen zwischen Chargen.
• Verwenden Sie stets Filterspitzen-Pipetten, sterile Verbrauchsmaterialien und spezielle Bereiche für Vor- und Nach-PCR, um das höchste Maß an Sicherheit und Genauigkeit zu gewährleisten.
• Halten Sie die Reagenzbestände ordnungsgemäß (vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen) und überprüfen Sie sie regelmäßig auf optimale Leistung.

3.6 Nachbearbeitung der Extraktion (Optional, aber entscheidend für schwierige Proben)

• Für Extrakte mit niedriger Reinheit verwenden Sie ein Reinigungskit (z. B. SPRI-Perlen, Silikagel-Säulen), um weitere Hemmstoffe zu entfernen.
• Falls erforderlich, führen Sie eine Größenselektion durch, um sehr kurze Fragmente (z. B. <200 bp) zu entfernen, die während der Bibliotheksvorbereitung dominieren könnten.
• Verwenden Sie DNA-Reparatur- oder Endpolierenzyme, um Nicks zu beheben, jedoch nur, wenn die Ausgangs-DNA einigermaßen intakt ist.

Häufige Kontaminationsquellen und wie man sie verhindert

Selbst wenn jeder molekulare Schritt technisch einwandfrei ist, kann Kontamination Ihren Sequenzierungslauf zunichte machen. Hier analysieren wir häufige Kontaminationswege und praktische Präventionsstrategien, die als Checkliste für das Labor präsentiert werden.

4.1 Arten der Kontamination in Sequenzierungs-Workflows

4.2 Präventionsstrategien: Ein Checklistenansatz

Hier ist eine praktische Checkliste, die Sie in Ihrem Labor übernehmen können, um das Kontaminationsrisiko zu reduzieren:

• ☐ Vollständig getrennte Bereiche für die prä-PCR (oder prä-Bibliothek) und die post-PCR/Bibliothek.Bringen Sie niemals Materialien stromaufwärts zurück.
• ☐ Verwenden spezialisierte Geräte und Verbrauchsmaterialien in jeder Zone (Pipetten, Röhrchen, Filterspitzen).
• ☐ Aliquot-Reagenzien (e.g., Primer, Puffer) in Einwegbehälter abfüllen, um wiederholtes Öffnen zu minimieren.
• ☐ Verwenden Sie aerosolresistente Filterspitzen. oder positive Verdrängungspipetten.
• ☐ Oberflächen und Werkzeuge dekontaminieren regelmäßig: Bleichmittel (10–15 %), UV-Bestrahlung und DNA-Decontaminationsreagenzien.
• ☐ Negative Kontrollen und Extraktionsleerräume einbeziehen in jedem Workflow-Durchlauf.
• ☐ Verfolgen Sie die Chargennummern von Reagenzkitten. und führen Sie Hintergrundprüfungen oder "Leerlaufprüfungen" durch, wenn Sie Chargen wechseln. (Die Variabilität von Reagenz-Kits ("Kitome") hat sich als unterschiedlich zwischen den Chargen erwiesen.)
• ☐ Bewegeung des Personals einschränken — Handschuhe, Laborkittel wechseln oder Schutzausrüstung anlegen, wenn Zonen gewechselt werden.
• ☐ Minimiere die PCR-Zyklen, insbesondere für stark amplifizierte Zielregionen, um die Übertragungsempfindlichkeit zu verringern
• ☐ Adopt dUTP + Uracil-DNA-Glykosylase (UNG) zur Vermeidung von Übertragung in der Bibliothek oder PCR-Vorbereitung, um Amplicon-Kontaminanten abzubauen.

4.3 Beispielmethode: UNG + dUTP zur Kontrolle von Übertragungen

Um die Kontamination durch Amplifikationsübertragung zu begrenzen, verwenden einige Labore dUTP in PCR-Produkten und setzen vor nachfolgenden Reaktionen Uracil-DNA-Glykosylase (UNG) ein. UNG spaltet Uracilbasen (in vorherigen Ampliconen) und macht kontaminierendes DNA nicht amplifizierbar, während native DNA-Vorlagen ohne Uracil unberührt bleiben.

Ein veröffentlichtes Protokoll passte dies für die zweistufige PCR-Bibliotheksvorbereitung an. Sie zeigten eine signifikante Reduzierung der Übertragungskontamination bei gleichzeitiger Beibehaltung der Bibliotheksausbeute und -vielfalt.

4.4 Hinweis: Kit-basierte Kontamination in metagenomischen Arbeitsabläufen

Eine aktuelle Studie untersuchte mehrere Marken von DNA-Extraktionsreagenzien und fand unterschiedliche "Hintergrund-Mikrobiota"-Signaturen, die für jede Kit-Charge einzigartig sind. Einige Reagenzien enthielten mikrobielle DNA, die das metagenomische Profiling beeinflussen könnte, wenn sie nicht kontrolliert wird.

Dies unterstreicht die Bedeutung der Verwendung von Reagenzblanks als interne Kontrollen und der vorsichtigen Interpretation von Reads mit geringer Häufigkeit.

Praktische Checkliste für die Qualitätskontrolle von Proben

Unten finden Sie eine umfassende, laborfreundliche Checkliste, die Sie verwenden können, um die Qualität Ihrer DNA/RNA zu überprüfen, bevor Sie in die Bibliotheksvorbereitung investieren. Nutzen Sie dies als Torwächter, um minderwertige Ausgangsmaterialien frühzeitig zu erkennen.

⚙️Beispiel QC-Checkliste: Schlüsselkennzahlen & Schwellenwerte

*Die Schwellenwerte können je nach Protokoll Ihrer Bibliothek und den Eingabemengen variieren; konsultieren Sie immer die Dokumentation Ihres Kits.

Implementierungsnotizen und Best Practices

• Dokumentiere jede QC-Metrik. in Ihrem LIMS oder Laborbuch. Erfassen Sie Rohdaten (z. B. Gel, Elektropherogramm) als Dateianhänge.
• Wenden Sie die Tore frühzeitig an. Wenn eine Probe die A260/230- oder fluorometrischen Überprüfungen nicht besteht, verschwenden Sie keine Reagenzien mit dem Versuch der Bibliotheksvorbereitung.
• Verwenden Sie Replikat-QC für kritische Proben. Besonders bei wertvollem Ausgangsmaterial sollten Duplikate von Quantifizierungs- oder Integritätsassays durchgeführt werden.
• Führen Sie Reagenzblanks parallel durch. Verarbeiten Sie "keine DNA/RNA"-Kontrollen, um Kit-Kontamination oder Hintergrundinterferenzen zu erkennen.
• Grenzwerte-Proben kennzeichnen. Weisen Sie ihnen eine Kategorie "Überwachen" zu – gehen Sie vorsichtig vor oder führen Sie zusätzliche Bereinigungsschritte durch.
• QC erneut nach den Reinigungs- oder Polierschritten. Wenn Sie zusätzliche Perlenreinigungen oder Größenauswahlen durchführen, wiederholen Sie die Quantifizierung und Integritätsprüfungen.

Link zu verwandten Inhalten

Für weitere Informationen zur Validierung und zu Metriken von Post-QC-Bibliotheken siehe unseren Artikel "Qualitätskontrolle vor der Sequenzierung: Sicherstellung der Datenintegrität", wo wir tiefer in Metriken wie Q30, Cluster-Dichte und Lesequalität eintauchen."

Außerdem steht dieser Artikel im Zusammenhang mit "Bibliotheksvorbereitungsstrategien für die Next-Generation-Sequenzierung", die beschreibt, wie QC-Gates in effiziente Bibliotheksarbeitsabläufe einfließen."

Fallstudie: Wie rigoröse Probenvorbereitung den Erfolg von NGS in einem CRO-ähnlichen Workflow rettete

In einer aktuellen institutionellen Analyse der Sequenzierung seltener Tumoren wurden etwa 14,7 % Von den Sequenzierungsläufen schlugen einige fehl, da das Ausgangsmaterial in Menge oder Qualität unzureichend war. (Itkin et al., 2025. DOI: https://doi.org/10.3892/mi.2025.226) Von den acht fehlgeschlagenen Tests, die erneut getestet wurden, waren sieben nach einer erneuten Extraktion oder Anpassungen an der Vorbereitung erfolgreich.

Lektionen für CRO-Umgebungen

Aus dieser Erfahrung können Laborteams und Projektmanager diese Strategien übernehmen:

In der Praxis könnte die Anwendung dieser Lektionen in Ihrer CRO-Umgebung die Fehlerraten von etwa 10 % auf unter 3 % senken.

Abbildung 1 - Flussdiagramm des Studienprotokolls. NGS, Next-Generation-Sequencing.

Nächste Schritte zur Verbesserung Ihres Sequenzierungs-Workflows

Um Ihr Verständnis zu vertiefen und die Probenvorbereitung nahtlos in Ihren umfassenderen Sequenzierungs-Workflow zu integrieren, finden Sie hier drei hochrelevante Ressourcen:

Wie man Primer für die DNA-Sequenzierung entwirft: Ein praktischer Leitfaden — Erfahren Sie, wie das Design von Primern den nachgelagerten Erfolg beeinflusst und helfen Sie, Amplifikationsbias zu vermeiden.

Wie man ein Gen sequenziert: Schritt-für-Schritt Experimentablauf — Erkunden Sie das vollständige End-to-End-Protokoll und setzen Sie die Probenvorbereitung in ihren breiteren Kontext.

Bibliotheksvorbereitungsstrategien für die Next-Generation-Sequenzierung — Tauchen Sie ein in die Methoden zur Adapterligierung, Größenselektion und andere Details zur Bibliothekskonstruktion.

Durch die Verknüpfung Ihrer QC- und Vorbereitungsentscheidungen mit diesen angrenzenden Themen schaffen Sie ein kohärentes Inhaltszentrum, das die Leser durch jede Phase der Sequenzierung führt.

Abschließende Erkenntnis

Hochwertige Sequenzierungsergebnisse beginnen lange bevor der Sequencer—bei der Probenvorbereitung. Wenn Sie strenge QC-Kriterien, Kontaminationskontrolle und Backup-Strategien umsetzen, erhöhen Sie Ihr Erfolgspotenzial erheblich.

Wenn Sie möchten:

• Überprüfen Sie Ihren bestehenden Vorbereitungsprozess.
• Entwickeln Sie benutzerdefinierte QC-Schwellenwerte für Ihr Labor.
• Sichern Sie sich ein Pilotsequenzierungsprojekt mit garantierter Leistung.

…unser Expertenteam für Sequenzierung ist bereit zur Zusammenarbeit. Kontaktieren Sie uns noch heute. Ihren Protokoll zu überprüfen oder eine Beratung anzufordern.

Häufig gestellte Fragen (FAQs)

Q: Was verursacht das Scheitern von Sequenzierungen?

Sequenzierungsfehler resultieren oft aus schlechter Probenqualität – niedrige DNA-Integrität, verbleibende Verunreinigungen (Phenol, Ethanol, Salze) oder Inhibitoren aus dem Extraktionsprozess können enzymatische Schritte wie Ligation oder PCR blockieren. Gelegentlich kann Kreuzkontamination oder Reagenzübertragung auch bei guter Eingangsqualität zu einem vollständigen Ausfall führen.

Q: Wie kann ich die DNA-Qualität für NGS verbessern?

Sie können die DNA-Qualität verbessern, indem Sie frisches oder ordnungsgemäß gelagertes Ausgangsmaterial verwenden, die Lysebedingungen optimieren, um ein Scheren zu vermeiden, zusätzliche Reinigungsschritte durchführen, um Inhibitoren zu entfernen, sanft in einem Puffer mit niedrigem Salzgehalt eluieren und automatisierte Extraktionssysteme mit konsistenter Leistung verwenden.

Q: Welche wichtigen Kennzahlen sollte ich überprüfen, bevor ich mit der Bibliotheksvorbereitung fortfahre?

Sie sollten die Reinheitsverhältnisse (A260/280 und A260/230), die genaue Konzentration durch Fluoreszenz (Qubit oder PicoGreen) und die Integrität (Gel, TapeStation oder Bioanalyzer) überprüfen. Eine negative Blankokontrolle hilft, Hintergrundkontaminationen zu erkennen, bevor Sie mit der Bibliotheksvorbereitung beginnen.

Q: Wie verhindere ich Kontamination in meinem Sequenzierungs-Workflow?

Verhindern Sie Kontamination durch physische Trennung von Pre- und Post-PCR-Bereichen, Verwendung von Filterspitzen und speziellen Instrumenten, Dekontamination (Bleichmittel, UV), Reagenz-Blanks, Aliquotierung von Reagenzien, Einschränkung der Bewegungen des Personals und optionaler Einsatz von dUTP/UNG-Systemen zur Eliminierung von Übertragungsampliconen.

F: Kann ich DNA-Proben von niedriger Qualität retten?

Manchmal. Wenn DNA mäßig unrein oder leicht degradiert ist, können Poliermaßnahmen (z. B. SPRI-Perlenreinigung, Größenselektion, Reparatur von Nicks) sie über die Schwellenwerte für die Bibliotheksvorbereitung heben. Allerdings kann stark fragmentierte oder stark kontaminierte DNA oft nicht vollständig gerettet werden, ohne sie erneut zu extrahieren.

Q: Warum ist die Quantifizierung durch UV (Nanodrop) oft unzuverlässig?

Die UV-Spektrophotometrie misst alle Nukleinsäuren und absorbierenden Substanzen – einschließlich freier Nukleotide, Primer und Verunreinigungen – was zu einer Überschätzung führt. Fluorometrische Methoden (z. B. Qubit) binden spezifisch an doppelsträngige DNA und sind genauer für die Bibliotheksvorbereitung.

Referenzen:

1. Lai Z, Su Y, Lin H, Wang S, Lin Y, Liang S, Chen W, Hsueh P. 2025. Entschlüsselung der Auswirkungen kontaminierender Mikrobiota in DNA-Extraktionsreagenzien auf metagenomische Next-Generation-Sequencing-Workflows. Microbiol Spectr 13:e03119-24.
2. Jansson L, Aili Fagerholm S, Börkén E, Hedén Gynnå A, Sidstedt M, Forsberg C, Ansell R, Hedman J, Tillmar A. Bewertung der DNA-Qualität für die Vorbereitung von Ganzgenom-Bibliotheken. Analytische Biochemie2024 Dez;695:115636. doi: 10.1016/j.ab.2024.115636. Epub 2024 Aug 5. PMID: 39111682.
3. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I. et al. Primer-BLAST: Ein Werkzeug zur Gestaltung von zielgerichteten Primern für die Polymerase-Kettenreaktion. BMC Bioinformatik 13, 134 (2012).
4. Wright CF, Morelli MJ, Thébaud G, Knowles NJ, Herzyk P, Paton DJ, Haydon DT, King DP. Jenseits des Konsenses: Zerlegung der viralen Populationsvielfalt innerhalb des Wirts des Fuß- und Mundkrankheitsvirus durch den Einsatz von Next-Generation-Genomsequenzierung. J Virol2011 Mar;85(5):2266-75. doi: 10.1128/JVI.01396-10. Epub 2010 Dez 15. PMID: 21159860; PMCID: PMC3067773.
5. Kopernik, A., Sayganova, M., Zobkova, G. u. a. Sanger-Validierung von WGS-Varianten. Wissenschaftliche Berichte 15, 3621 (2025).
6. Lusk RW. Vielfältige und weit verbreitete Kontaminationen sind in den unkartierten Tiefen von Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten offensichtlich.. PLoS One2014, 29. Oktober; 9(10): e110808. doi: 10.1371/journal.pone.0110808. PMID: 25354084; PMCID: PMC4213012.
7. Kuwata T, Wakabayashi M, Hatanaka Y, Morii E, Oda Y, Taguchi K, Noguchi M, Ishikawa Y, Nakajima T, Sekine S, Nomura S, Okamoto W, Fujii S, Yoshino T; SCRUM-Japan GI-SCREEN Pathologiegruppe. Einfluss der DNA-Integrität auf die Erfolgsquote von gewebebasiertem Next-Generation-Sequencing: Lehren aus dem landesweiten Krebsgenom-Screening-Projekt SCRUM-Japan GI-SCREEN. Pathol Int. 2020 Dez;70(12):932-942. doi: 10.1111/pin.13029. Epub 2020 Okt 8. PMID: 33030786; PMCID: PMC7820973.