Bibliotheksvorbereitungsstrategien für die Next-Generation-Sequenzierung

Einführung — Warum die Bibliotheksvorbereitung den Erfolg der Sequenzierung bestimmt

In der modernen NGS Arbeitsabläufe, Die Bibliotheksvorbereitung ist nicht nur ein erster Schritt – sie bestimmt oft den Erfolg oder Misserfolg des gesamten Laufs.Schlechte Bibliotheksvorbereitung kann zu niedrigen Erträgen, hohen Duplikationsraten, ungleichmäßiger Abdeckung oder Ablehnung des Laufs durch den Sequencer führen.

In einem typischen Hochdurchsatz-Genomik-Labor wird geschätzt, dass Über 50 % der Fehler oder suboptimalen Durchläufe sind auf Probleme bei der Bibliotheksvorbereitung zurückzuführen.—ob unzureichende Adapterligatur, Überamplifikationsbias oder verbleibende Verunreinigungen.

Darüber hinaus, während NGS in CRO- und institutionellen Umgebungen an Bedeutung gewinnt, Umwandlungseffizienz (d.h. der Anteil der Eingabefragmente, die zu sequenzierfähigen Molekülen werden) wird zu einer wichtigen Kennzahl. Eine hohe Umwandlungsrate bedeutet weniger PCR-Zyklen, weniger Verzerrungen und eine stärkere Bibliothekskomplexität.

Für Forschungslabore und Auftragsforschungsinstitute (CROs) ist die Folgerung klar: Zeit und Sorgfalt in die Bibliotheksvorbereitung zu investieren, führt zu zuverlässigeren Sequenzierungsdaten, weniger Wiederholungen und besseren Ergebnissen für die nachgelagerte Bioinformatik. In diesem Artikel gehen wir auf jede Phase ein – Fragmentierung, Endreparatur, Adapterligatur, Amplifikation – und zeigen, wie man sie optimieren kann (insbesondere in Illumina vs Oxford Nanopore Kontexte).

Wenn Sie eine Auffrischung zu den vorhergehenden Probenvorbereitungs-Schritten (DNA/RNA-Isolation, Proben-QC) wünschen, siehe Probenvorbereitung für hochwertige Sequenzierungsergebnisse.

Was sind die Hauptschritte bei der NGS-Bibliotheksvorbereitung?

Bevor man in jedes technische Detail eintaucht, ist es nützlich, die gesamt Arbeitsablauf NGS-Bibliotheksvorbereitung auf einen Blick:

1. Fragmentierung — DNA (oder cDNA) in handhabbare Größen zerlegen
2. Endreparatur & A-Tailing — Enden in ligationskompatible Formate umwandeln
3. Adapter-Ligation — Sequenzierungsadapter und Barcode anbringen
4. Bereinigung/Größenauswahl — unerwünschte Fragmente und verbleibende Reagenzien entfernen
5. Bibliotheksamplifikation (optional) — verstärken Sie adapter-ligierte Moleküle, falls erforderlich
6. Bibliotheks-QC und Quantifizierung — Konzentration, Größenverteilung, Integrität überprüfen

Diese Schritte zusammen bilden die Sequenzierungs-Workflow von der Eingabemuster bis zur bibliotheksbereiten Vorbereitung für das Laden auf ein Flusszellen- oder Sequenziergerät. (Qiagen listet die gleichen vier Kernstufen: Fragmentierung, Endreparatur, Adapterligatur und optionale Amplifikation).

Unten finden Sie eine kurze Erklärung jeder Phase:

2.1 Fragmentierung

• DNA (oder cDNA) wird in Fragmente innerhalb eines Zielgrößenbereichs zerlegt (z. B. 200–600 bp für Illumina).
• Methoden umfassen mechanisches Schneiden (Sonikation, akustisches fokussiertes Scheren, Nebulisation) und enzymatische Verdauung (Endonukleasen, Transposasen).
• Manchmal Tagmentierung (transposase-basierte Fragmentierung + Adapter-Tagging) kombiniert Schritte.

2.2 Endreparatur & A-Tailing

• Nach der Fragmentierung können die DNA-Enden Überhänge (5′ oder 3′) oder stumpfe Enden aufweisen.
• Endreparatur verwendet DNA-Polymerasen und Exonukleasen, um unebene Enden zu glätten; Polynukleotidkinase phosphoryliert 5′-Enden.
• A-Tailing fügt typischerweise ein einzelnes Adenin (A) Nukleotid an die 3′-Enden hinzu, um die Ligation an Adapter mit komplementären Thymin (T) Überhängen zu ermöglichen.

2.3 Adapter-Ligation

• Sequenzierungsadapter (mit Sequenzen für die Flusszelle, Barcodes/Indizes und manchmal molekularen Barcode-Sequenzen) werden mit DNA-Ligasen (z. B. T4-DNA-Ligase) an die Enden der Fragmente ligiert.
• Überschüssige Adapter und Adapter-Dimer müssen durch Reinigung entfernt werden.

2.4 Bereinigung & Größenwahl

• Nach der Ligation (oder nach der Amplifikation in einigen Protokollen) werden die Bibliotheken gereinigt, um kleine Fragmente, unligierte Adapter, Enzyme und Pufferkomponenten zu entfernen.
• Häufig verwendete Methoden: magnetische Perlen (AMPure-Stil), Gel-Extraktion oder Säulenreinigung.
• Die Größenwahl stellt sicher, dass Bibliotheken in das optimale Einfügegrößenfenster für die Sequenzierung fallen.

2.5 Bibliotheksverstärkung (Optional)

• Wenn die Eingangs-DNA niedrig ist oder das Protokoll es erfordert, wird PCR verwendet, um adapter-ligierte Fragmente zu amplifizieren.
• Hochfidelitäts-Polymerasen werden bevorzugt, um Fehler und Verzerrungen zu reduzieren.
• Die Anzahl der Zyklen sollte minimiert werden, um Überverstärkungsartefakte und verzerrte Darstellungen zu vermeiden.

2.6 Bibliotheks-QC und Quantifizierung

• Vor dem Laden werden Bibliotheken auf Konzentration (z. B. qPCR, Fluorometrie), Größenverteilung (z. B. Bioanalyzer, TapeStation) und manchmal auf Molarität (molare Konzentration) bewertet.
• Diese QC-Metriken sind entscheidend für die Erreichung einer ausgewogenen Clusterbildung und optimalen Erträgen.
• Einige Plattformen erfordern sehr präzise molare Konzentrationen und niedrige Adapter-Dimer-Fraktionen.

Schritt 1 – DNA-Fragmente: Kontrolle der Insertgrößenverteilung

Fragmentierung ist der erste – und oft einer der kritischsten – Schritte in NGS-BibliotheksvorbereitungDas Ziel ist es, einen Pool von DNA- (oder cDNA-) Fragmenten zu erzeugen, deren Größe einfügen (d.h. ohne Adapter) entspricht der beabsichtigten Leselänge und Sequenzierungschemie. Schlechte Fragmentierung führt zu verzerrten Insertverteilungen, überlappenden Reads, Amplifikationsbias und Abdeckungsproblemen.

3.1 Fragmentierungsansätze: Mechanische, enzymatische und hybride Methoden

Mechanisches Schneiden

• Mechanische Methoden brechen DNA durch physikalische Kräfte, einschließlich akustischem Scheren (z. B. Covaris), hydrodynamischem Scheren (z. B. Spritzen, zentrifugenbasierten Strahlen) oder Nebelbildung.
• Akustisches Scheren (Fokussierte Akustische Energie / Adaptive Fokussierte Akustik) wird aufgrund seiner engen Größenverteilung und Reproduzierbarkeit häufig verwendet und ist relativ unvoreingenommen in Bezug auf den GC-Gehalt.
• Vorteile: minimale Sequenzverzerrung, gut charakterisierte Fragmentierung, robuste Wiederholbarkeit
• Nachteile: erfordert spezialisierte Ausrüstung, Schritte zur Probenhandhabung können zu Verlust oder Beschädigung führen, die Skalierung des Durchsatzes ist nicht trivial.

Enzymatische Fragmentierung

• Enzymatische Fragmentierung verwendet Nuklease-Cocktails (Endonukleasen, dsDNA-Fragmentasen oder Transposasen), um DNA zu spalten.
• Eine beliebte Variante ist Tagmentierung (z. B. im Nextera-Stil), bei dem eine Transposase DNA fragmentiert und in einem einzigen Schritt partielle Adaptersequenzen anfügt.
• Einige moderne Kits integrieren Fragmentierung, Endreparatur und A-Tailing in eine einzige Reaktion, minimieren die Probenübertragungen und reduzieren den Verlust.
• Vorteile: geringe DNA-Eingabe, automatisierungsfreundlich, niedrigere Gerätekosten
• Nachteile: potenzieller Sequenzbias (Präferenz für spezifische Motive oder GC-Gehalt), kleinerer dynamischer Bereich der Insertgrößen, Empfindlichkeit gegenüber Schwankungen im Verhältnis von Enzym zu DNA.

Hybrid- / Alternativmethoden

• Einige Protokolle kombinieren mechanische und enzymatische Schritte, um ein Gleichgewicht zwischen Verzerrung und Bequemlichkeit zu erreichen.
• Chemische Fragmentierung (z. B. Wärme + zweiwertige Kationen) wird gelegentlich verwendet (insbesondere zur Fragmentierung von RNA), ist jedoch seltener bei DNA.
• Bei stark degradiertem DNA (z. B. FFPE) kann die Fragmentierung übersprungen oder reduziert werden, wenn bereits eine natürliche Fragmentierung vorliegt.

3.2 Auswahl einer Fragmentierungsmethode: Wichtige Überlegungen

Bei der Auswahl eines Fragmentierungsansatzes sollten CROs und Sequenzierungslabore Folgendes abwägen:

3.3 Fragmentierungsoptimierung und Fallstricke

Überfragmentierung vs. Unterfragmentierung

• Sie müssen die Reaktionszeit und die Enzymkonzentration (oder die Sonikationsparameter) optimieren, um Fragmente zu vermeiden, die zu kurz sind (was zu einer Dominanz von Adapter-Dimeren führt) oder zu lang (was zu schlechter Clusterbildung oder niedrigem Durchsatz führt).

Chargenübergreifende Konsistenz

• Enzymemengen oder Pufferbedingungen können variieren. Validieren Sie immer die Fragmentierungsprofile über die Chargen hinweg.

Fragmentierungsbias-Verbesserung

• Neuere kommerzielle Enzymkits haben sich verbessert, um Motif- und GC-Bias zu reduzieren (Ribarska et al., 2022).
• In ihrer vergleichenden Studie lieferten mehrere enzymatische Fragmentierungskits eine ähnliche Leistung wie die Tagmentierung bei der SNV/Indel-Erkennung in Proben mit niedrigem Input.

Auswirkungen der Fragmentgröße auf die nachgelagerte Kartierung

• Wenn die Fragmenteinfügungen die Summe der Lese-längen überschreiten, wird die Überlappung verringert, was die einzigartig kartierbaren Basen erhöht. Zu lange Inserts können jedoch die Cluster-Dichte oder die Sequenzierungseffizienz verringern.

Probenverlust und Handhabungsartefakte

• Mechanische Fragmentierung umfasst häufig Transfers (z. B. Röhren, Scherbehälter), die zu Probenverlust oder -beschädigung führen können. Enzymatische Methoden, die in einem einzigen Röhrchen bleiben, verringern dieses Risiko.

Abb. 1. Bewertung der DNA-Insertgröße von Bibliotheken, die mit enzymatischer Fragmentierung und Tagmentation vorbereitet wurden.

Schritt 2 – Endreparatur & A-Tailing: Vorbereitung von Fragmenten für die Adapterkompatibilität

Sobald Ihre DNA-Fragmente erzeugt sind, enthalten ihre Enden oft eine Mischung aus 5′-Überhängen, 3′-Überhängen oder stumpfen Termini. Die Endreparatur und A-Tailing Schritte zur Umwandlung dieser heterogenen Enden in ein einheitliches Format, das bereit für die Adapterligierung ist. Eine sorgfältige Optimierung an dieser Stelle verbessert die Ligierungseffizienz und reduziert Nebenprodukte wie Adapter-Dimere.

4.1 Endreparatur: Abflachung & Phosphorylierung

• Ziel: Konvertieren Sie alle Fragmentenden zu stumpfen, phosphorylierten Enden (5'-Phosphat und 3'-Hydroxyl), um die Bindung des Ligase zu ermöglichen.
• Häufig beteiligte Enzyme:
  1. T4 DNA-Polymerase (füllt 5′ Überhänge aus, kürzt 3′ Überhänge zurück)
  2. DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment, exo– Varianten) in einigen Protokollen
  3. T4 Polynukleotidkinase (PNK) für die 5′-End-Phosphorylierung
• Mechanismus:
  1. Überstände werden „ausgefüllt“ oder gekürzt, um stumpfe Enden zu erzeugen.
  2. Die 5′-Enden der Fragmente sind phosphoryliert (sofern nicht bereits).
  3. Überschüssige dNTPs können hinzugefügt werden, um Füllreaktionen zu ermöglichen.
• Best Practices:
  1. Verwenden Sie Reaktionspuffer, die für die kombinierte Enzymaktivität optimiert sind.
  2. Stellen Sie Master-Mischungen im Voraus zusammen, um Pipettierabweichungen zu reduzieren.
  3. Begrenzen Sie die Reaktionszeit, um unspezifische Exonukleaseaktivität zu vermeiden.
• Referenz: Cytiva beschreibt, wie T4-Polymerase und PNK für diesen Schritt von zentraler Bedeutung sind.

4.2 A-Tailing: Hinzufügen eines einzelnen 3′ Adenin-Überhangs

Zweck: Nach dem Abflachen, ein nicht-templatiertes Ein wird an das 3′-Ende jedes Fragments angehängt, damit es sich mit Adaptern verbinden kann, die ein komplementäres T Überhang – dies hilft, die Fragment-Fragment-Ligation zu verhindern.

Verwendete Polymerasen:

• Taq DNA-Polymerase wird oft verwendet, da es von Natur aus einen 3′ A-Überhang hinzufügt.
• Einige Protokolle verwenden Klenow-Fragment (exo–) oder proprietäre Enzymmischungen.

Typische Protokollbedingungen:

• Temperatur ~ 65 °C (um sowohl die Endreparaturenzyme zu inaktivieren als auch die A-Zugabe zu begünstigen)
• Dauer ~ 10–30 Minuten (variiert je nach Kit)
• Der Puffer enthält dATP (häufig im Überschuss).

Hinweis zur Kombination: Einige moderne Kits kombinieren Endreparatur und A-Tailing in einem. Einzelreaktion ("One-Pot")Nach dem Ende arbeiten Reparaturenzyme bei niedrigerer Temperatur (z. B. 20 °C), die Mischung wird auf 65 °C erhitzt, um diese Enzyme zu inaktivieren und A-Tailing-Enzyme wie Taq zu aktivieren.

4.3 Optimierungstipps und häufige Fallstricke

• Ausbalancierung der Enzymverhältnisse: In Ein-Topf-Mischungen die Verhältnisse optimieren, damit das A-Tailing nicht vorzeitig beginnt und die Bildung von stumpfen Enden vollständig ist.
• Vermeidung von Überhängen bei der Übertragung: Unvollständiges Ausfüllen oder das Trimmen von Überständen führt zu Fehlanpassungen und Ligationsfehlern.
• Minimierung von Überdehnung: Zu lange Inkubation oder überschüssige Polymerase können die stumpfen Enden über die beabsichtigte Länge hinaus verlängern.
• Beispielhafte Eingabebeschränkungen: Niedriginput-Proben können unter unvollständiger Endreparatur oder Verlust leiden; verwenden Sie Reaktionen mit reduziertem Volumen und hochwirksame Enzyme.
• Chargenkonsistenz: Validieren Sie zwischen Enzymchargen; kleine Änderungen in der Pufferzusammensetzung können die Aktivität beeinflussen.

Enzyminaktivierungsstrategie: Viele Protokolle basieren auf der Hitzedeaktivierung (z. B. 65 °C), um alle enzymatischen Aktivitäten vor der Ligation zu beenden.

Schritt 3 – Adapterligierung: Maximierung der Effizienz und Reduzierung von Dimeren

Die Adapterligierung ist ein entscheidender Schritt, bei dem Sequenzierungsadapter kovalent an Ihre vorbereiteten DNA-Fragmente angefügt werden. Eine effiziente Ligierung hat tiefgreifende Auswirkungen auf Bibliotheksumwandlung, Tiefenuniformität und downstream-Bias. Schlechte Ligation führt zu Adapter-Dimeren, Selbstligationen oder Verlust der Bibliothekskomplexität.

5.1 Adapterstruktur und Designgrundlagen

Kernkomponenten eines Adapters:

• Flusszellenbindungsregionen (z. B. P5/P7 für Illumina), die eine Bibliotheksbindung an die Sequenzieroberfläche ermöglichen
• Bindestellen für Sequenzierungsprimer (Lese 1 / Lese 2 Primer-Bindungsregionen)
• Index (Barcode)-Sequenzen für Multiplexing (i5, i7)
• Optionale einzigartige Sequenz-Barcodesin den Adapter eingebettet, um einzelne Moleküle zu kennzeichnen

• (Diese strukturellen Motive sind standardmäßig in ligationsbasierten Bibliotheksvorbereitungssystemen.)

Adapterüberhangdesign:

• Typischerweise sind Adapter so konzipiert, dass sie ein T-Überhang (3′-T) ergänzt die A-besetzten DNA-Fragmente (3′-A). Dies gewährleistet eine gerichtete Ligation und verringert die Wahrscheinlichkeit einer Adapter-zu-Adapter-Ligation.

Vollständige (Y-förmige) vs. Stub-Adapter:

• Vollständige Adapter enthalten bereits alle Motive (Indizes, P5/P7), sodass keine weitere PCR zur Hinzufügung von Adaptern erforderlich ist.
• Stub (truncated) Adapter erfordern einen nachfolgenden PCR-Schritt, um Indizes oder Flusszellensequenzen anzufügen.

5.2 Mechanik der Ligation und Kits

Enzym- und Puffersysteme

• Gewöhnlich, T4 DNA-Ligase (or hochkonzentrierte Versionen) wird verwendet, um Adapter an A-besäumte Fragmente zu ligieren. NEBs Blunt/TA Ligase Master Mix ist ein Beispiel für ein Kit, das für die Ligierung von dsDNA-Adaptern optimiert ist und Ligase, Puffer und Enhancer in einem Mix kombiniert.
• Das Kit-Protokoll empfiehlt die Verwendung eines 5–10-fache molare Überlegenheit des Adapters die Ligation voranzutreiben.

Reaktionsbedingungen

• Die Ligatur wird häufig durchgeführt bei Raumtemperatur (~20–25 °C) für 15–30 Minuten (für die stumpfe Ligation) oder bei eine niedrigere Temperatur (z. B. 12–16 °C über Nacht) für kohäsive Endligierung zur Verbesserung des Ertrags, insbesondere bei Proben mit niedrigem Input.
• Einige Protokolle führen eine "schnelle Ligation" (5–10 Minuten bei Raumtemperatur) durch, insbesondere in Kit-Formaten.
• In vielen Arbeitsabläufen folgen unmittelbar Reinigungsschritte (z. B. Bead-Reinigung), um überschüssige Adapter und Enzyme zu entfernen.

Kinetik und molare Verhältnisse

• Das Erreichen eines optimalen Verhältnisses von Adapter zu Insert ist entscheidend: Zu wenig Adapter führt zu ungeliegten Fragmenten; zu viel Adapter verursacht die Bildung von Adapter-Dimeren.
• Für die stumpfe Ligation (wenn die Adapter stumpf enden), kann ein noch höherer Adapterüberschuss (z. B. 20×) erforderlich sein.
• Einige Studien zu Sequenzierungsplattformen beobachten optimale Ligationserträge bei hohen Adapterverhältnissen (z. B. 100:1), obwohl eine Überfülle das Risiko der Bildung von Nebenprodukten birgt.

5.3 Strategien zur Minimierung von Adapter-Dimeren und Artefakten

Größenausschluss/Reinigung unmittelbar nach der Ligation

• Verwenden Sie magnetische Perlen (z. B. SPRI oder ein gleichwertiges Produkt), um kleine Adapterfragmente und freie Adapter zu entfernen. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit, dass Adapter-Dimere in die PCR oder Sequenzierung gelangen.

Verwendung von blockierten Adaptern oder Haarspangen-Blockern

• Einige Adapterdesigns enthalten 3′-Blockierungsgruppen oder invertiertes dT, um die Selbstligierung der Adapter zu verhindern und die Dimerbildung zu reduzieren.

Optimieren Sie die Ligationdauer und -temperatur..

• Niedrigere Temperaturen und längere Zeiten verbessern oft den Ligationsertrag für Proben mit niedrigem Input, während sie unerwünschte Ligationen reduzieren.
• Umgekehrt kann eine Hochtemperatur-Schnellligatur zwar die Geschwindigkeit begünstigen, aber in einigen Fällen unerwünschte Nebenprodukte erhöhen.

Adapterreinigung und -handhabung

• Verwenden Sie frische, hochwertige, HPLC-reinige oder PAGE-reinige Adapterbestände.
• Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen.
• Anneal Sie die Adapter entsprechend (wenn Duplex) kurz vor der Ligation, um eine korrekte Duplexbildung sicherzustellen.
• Vorverdünnte Adapter in Röhrchen mit geringer Bindung und Puffer verwenden, um Adsorptionsverluste zu minimieren.
• (Illumina betont, dass degradierte oder falsch angepasste Adapter den Ligationsertrag verringern.)

Entfernung des Überschussadapters vor der PCR

• Nach der Ligation hilft eine gründliche Reinigung, die Übertragung von freien Adaptern in die PCR zu reduzieren, wodurch die Amplifikation von Adapter-Adapter verringert wird.

5.4 Optimierungs- und Fehlersuche-Tipps

Q: Wie optimiert man die Adapterligatur für NGS?

• Titration von Adapter-zu-Einsatz-Molverhältnissen (z. B. 5×, 10×, 20× testen).
• Verwenden Sie hochkonzentrierte Ligase-Mischungen (z. B. Mastermischungen mit Enhancern).
• Verlängern Sie die Ligation-Zeit oder senken Sie die Temperatur für Proben mit niedrigem Input oder schwierigen Proben.
• Führen Sie sofort eine Reinigung durch, um überschüssige Adapter und Enzyme zu entfernen.

Q: Warum bilden sich Adapter-Dimere?

• Überschüssige Adapter können sich miteinander verbinden.
• Adapter mit kompatiblen Überständen (wenn nicht blockiert) können sich selbst ligieren.
• Unvollständige Bereinigung führt dazu, dass Adapterfragmente in nachgelagerte Schritte überleben.

A: Was sind die Anzeichen für eine schlechte Ligatur?

• Hoher Anteil des Adapter-Dimer-Peaks auf dem Bioanalyzer/Fragmentanalysator (~120–140 bp).
• Niedrige Gesamtligierungsbibliothekskonzentration.
• Schlechte Komplexität bei der Next-Generation-Sequenzierung (uneinheitliche Abdeckung, niedrige Ausbeute).

Schritt 4 – Bibliotheksamplifikation & Aufreinigung: Minimierung von Verzerrungen bei gleichzeitiger Maximierung des Ertrags

Sobald die Adapter ligiert sind, erfordern viele Bibliotheksprotokolle ein PCR-Amplifikationsschritt um adapter-ligierte Fragmente anzureichern und eine ausreichende Ausbeute für das Sequenzieren zu erreichen. Allerdings bringt die Amplifikation Risiken mit sich – Verzerrungen, Duplikate und Polymerasefehler. Eine sorgfältige Anpassung der Amplifikation und Reinigung ist entscheidend, um die Komplexität der Bibliothek und die Datenintegrität zu bewahren.

6.1 Wann Amplifikation vs. PCR-freie Arbeitsabläufe

• Wenn Ihre Eingangs-DNA ausreichend ist (z. B. > 500 ng für Illumina TruSeq PCR-frei), können Sie die PCR vollständig überspringen. PCR-freie Bibliotheken reduzieren Amplifikationsbias und verbessern die Abdeckungsuniformität, insbesondere bei extremen GC-Gehalten.
• Aber bei Proben mit niedrigem Input, degradierten oder wertvollen Materialien ist eine begrenzte PCR oft unvermeidlich. In solchen Fällen besteht das Ziel darin, die Anzahl der Zyklen zu minimieren und optimierte Polymerasen zu verwenden, um Artefakte zu reduzieren.

6.2 Auswahl von Polymerasen und Mastermixen: Minderung von Verzerrungen und Fehlern

• Benutzen hochpräzise, Korrekturlese-Polymerasen (3′→5′ Exonukleaseaktivität), um die fehlerhafte Einfügung von Basen, chimäre Produkte und Template-Switching zu reduzieren.
• Einige Polymerasen sind so konstruiert, dass sie eine einheitliche Amplifikation in GC-reichen und AT-reichen Regionen ermöglichen. Zum Beispiel wird KAPA HiFi häufig als einer der besten Performer in Tests zur einheitlichen Abdeckung bei unterschiedlichem GC-Gehalt genannt.
• Seien Sie vorsichtig mit den Rampenraten des Thermocyclers: langsames Ramping kann die Verzerrung bei GC-reichen Vorlagen verringern, indem es eine vollständigere Denaturierung ermöglicht.
• Einige Anbieter bieten Master-Mischungen an, die für die NGS-Bibliotheksamplifikation optimiert sind und Enzyme, Puffer und Verstärker kombinieren, um Ertrag und Gleichmäßigkeit auszubalancieren (z. B. die Collibri-Amplifikationsmischungen von Thermo Fisher).
• Für herausfordernde Templates (z. B. hoch-AT, hoch-GC, lange Amplicons) können Additive oder Verstärker (z. B. Betaine, DMSO) hilfreich sein – sollten jedoch validiert werden.

6.3 PCR-Zyklusnummer, Strategie und beste Praktiken

• Zyklen minimierenBegrenzen Sie die Amplifikation auf die niedrigste erforderliche Anzahl (z. B. 4–8 Zyklen, die in guten Bibliotheken üblich sind), um Verzerrungen durch Überamplifikation zu reduzieren.
• Zwei-Stufen (verschachtelte) PCREinige Protokolle teilen die Amplifikation in kürzere "Pre-PCR" und "Indexierungs-PCR", um Verzerrungen zu verteilen.
• Touchdown/Gradient-TemperierungEin höherer Anlasstemperatur zu beginnen und diese allmählich zu senken, kann die Spezifität in den frühen Zyklen verbessern.
• Pooling vor der PCRDie Multiplexbibliotheken (mit unterschiedlichen Indizes) und das Pooling vor der Amplifikation können die stichprobenbezogene Verzerrung verringern.
• Überwachung der AmplifikationskinetikEchtzeit-qPCR oder Kleinmaßstab-Testreaktionen helfen, Überzyklen zu vermeiden, wenn das Plateau erreicht ist.

6.4 Bereinigung und Größenwahl nach der Amplifikation

• Nach der PCR ist eine Reinigung erforderlich, um Primer, Nukleotide, Enzyme und unerwünschte Nebenprodukte zu entfernen.
• Magnetische Perlen-basierte Reinigung (z.B. SPRI / AMPure) Es ist Standard: Sie können unterschiedliche Verhältnisse von Perlen zu Proben verwenden, um kleine Fragmente oder Adapter-Dimere auszuschließen.
• Doppelseitige GrößenwahlVerwenden Sie zwei aufeinanderfolgende Perlenreinigungen (zuerst niedrig- dann hochschnitt), um die Fragmentgrößenverteilung genau zu steuern.
• Gel- oder KapillarauswahlFür extrem enge Einschnittgrößenfenster oder um Adapter-Dimere manuell zu entfernen, können Gel/Agarose oder Pippin Prep / BluePippin verwendet werden.
• Vermeiden Sie das Übertrocknen von Perlen.Übertrocknung verringert die Elutionseffizienz und die Ausbeute.
• Elutionsvolumen und PufferVerwenden Sie ein Puffer mit niedrigem Elutionsvolumen und niedrigem EDTA (oder TE mit niedrigem EDTA), um die Bibliothek für die Qualitätskontrolle zu konzentrieren.

6.5 Auswirkungen auf die Bibliotheksqualität: Verzerrungen, Duplikate und Einheitlichkeit

• PCR-Bias und GC-SkewDie Amplifikation begünstigt mid-GC-Sequenzen; Extreme (sehr GC-reiche oder AT-reiche) könnten unterrepräsentiert sein.
• DuplikationsratenÜberverstärkung führt zu vielen doppelten Reads, was die effektive Bibliothekskomplexität verringert.
• Chimärenbildung/VorlagenwechselBei Hochzyklus- oder Überlastreaktionen können Fragmente rekombinieren und artefaktische Verbindungen erzeugen.
• AbdeckungsunregelmäßigkeitEinige Regionen können aufgrund von Amplifikationsartefakten über- oder unterrepräsentiert werden, was nachgelagerte Analysen wie Variantenaufrufe oder Assemblierung kompliziert.

6.6 FAQ: Häufige Bedenken & Optimierungstipps

Q: Wie viele PCR-Zyklen sind "zu viele"?

Strebe nach dem Minimum, das deine Zielkonzentration erreicht (oft 4–8 Zyklen). Sobald das Plateau der Fluoreszenz/qPCR erreicht ist, verstärken weitere Zyklen meist Duplikate und führen zu Verzerrungen.

F: Wie erkennt man Überverstärkung oder Chimären?

• Verwenden Sie Fragmentanalysatoren / Bioanalyzer: stark ausgeprägte kleinere Spitzen können auf Adapterdimeren oder chimären Fragmenten hindeuten.
• Überwachen Sie die Duplikationsstatistiken nach der Sequenzierung; übermäßige Duplikation deutet auf eine Überamplifikation hin.

Können molekulare Barcodes helfen?

Ja. Die Einbeziehung einzigartiger Sequenz-Barcodes vor der Amplifikation ermöglicht es, echte biologische Duplikate von PCR-Duplikaten in der Analyse zu unterscheiden – was hilft, die Amplifikationsverzerrung zu korrigieren.

Plattform-spezifische Bibliotheksvorbereitung: Illumina vs. Oxford Nanopore

Während der wesentlichen Schritte von NGS-Bibliotheksvorbereitung (fragmentierung, Endreparatur, Ligation und Aufreinigung) gelten allgemein, jedoch stellen die Illumina- und Oxford Nanopore (ONT) Plattformen unterschiedliche Anforderungen und Kompromisse. Die Auswahl der richtigen Strategie kann den Ertrag, die Lesequalität und die Bibliothekskomplexität maximieren.

7.1 Wichtige Unterschiede in den Bibliotheksanforderungen

Diese Unterschiede beeinflussen, wie man Fragmentierung, Adapterligierung und Aufreinigung gestaltet.

7.2 Illumina Bibliotheksvorbereitung: Höhepunkte und Tipps

• Fragmentierungsfokus: Einheitliche Inserts von ~200–500 bp sind entscheidend, da die Illumina-Lesechemie keine langen Fragmente abdecken kann.
• Adapter-Schema: Illumina verwendet Y-förmige Adapter mit doppelten Indizes. Nach der Ligation wachsen die Cluster von beiden Enden.
• PCR-freie Optionen: Wenn die Eingabe ausreichend ist, helfen PCR-freie Kits (z. B. TruSeq DNA PCR-frei), Amplifikationsbias zu vermeiden und eine gleichmäßige Abdeckung zu verbessern.
• Größenauswahl-Strenge: Engpassfenster (z. B. durch Verwendung von doppelseitigem SPRI oder gelbasierter Selektion) reduzieren Dimere und nicht passende Fragmente.
• Überlappung und Zusammenführung von Lesevorgängen: Bei paired-end 150 bp Reads können Fragmente, die kürzer als 300 bp sind, sich überlappen – ein optimales Design vermeidet zu kurze Inserts.

7.3 Nanopore-Bibliotheksvorbereitung: Höhepunkte und Tipps

• Langzeitfragmenterhaltung: Je länger Ihre DNA-Fragmente sind (bis zu mehreren zehn oder hundert kb), desto mehr Vorteile ergeben sich bei der Assemblierung und strukturellen Variation. Verwenden Sie eine sanfte Handhabung und vermeiden Sie übermäßiges Scheren.
• Ligation-Sequenzierungsadapter: ONT-Kits verwenden ein Motorprotein oder eine Verbindung, die die DNA durch die Pore lenkt; Adapter müssen diese Verbindung berücksichtigen.
• Barcode-Strategie: ONT bietet native Barcode-Kits die eine Barcode-Erstellung vor oder während der Adapterligatur ermöglichen. Dies bietet Flexibilität beim Multiplexing von Langlauf-Experimenten.
• Keine Verstärkungs-Workflows: Viele ONT-Workflows überspringen die PCR vollständig und bewahren die native Darstellung und Modifikationen (z. B. Methylierung).
• Reinigungspflege: Verwenden Sie eine Breitschnitt-Perlenreinigung oder sanfte Pufferlösungen – eine aggressive Reinigung kann sehr lange Fragmente beschädigen.
• Schadenreparatur/Endreparatur: Da lange DNA möglicherweise Einschnitte aufweist, ist eine Vorbehandlung mit Reparaturmischungen (z. B. End Repair/dA-Tailing aus den Kits von ONT) vor der Ligation entscheidend.

7.4 Hybride und spezialisierte Strategien und Abwägungen

• Hybride Sequenzierungsansätze: Viele Projekte kombinieren Illumina (für hohe Genauigkeit) und ONT (für lange Kontinuität) Daten; in diesen Fällen hilft die Übereinstimmung von QC der Bibliotheksvorbereitungseingaben und Fragmentgrößenprofilen bei der Integration.
• Tagmentationskompatibilität: Während die Tagmentierung bei Illumina üblich ist, wird sie bei ONT selten verwendet, da die Kontrolle der Fragmentlängenverteilung schwieriger ist.
• Niedrigeingangs- / degradierte DNA: Für degradierte oder niedrig-input Proben können beide Plattformen Schwierigkeiten haben. Der Einsatz von enzymatischer Fragmentierung, Reaktionen mit geringem Volumen und optimierter Aufreinigung hilft.
• Plattformwechsel: Einige neuere Illumina-Assays zielen darauf ab, die Leselänge zu verlängern (z. B. Infinity-Technologie). Während sich die Technologien von Illumina und ONT weiterentwickeln, könnten die Methoden zur Bibliotheksvorbereitung in hybriden Designs zusammenwachsen.

7.5 Praktische Empfehlungen für CROs / Forschungslabore

1. Passen Sie Ihr Projektziel an die Stärken der Plattform an..

Wenn Ihr Ziel die Variantenbestimmung auf bekannten Referenzen ist, ist Illumina oft die bevorzugte Wahl. Für de novo Assemblierung oder strukturelle Variationen ist ONT ein leistungsstarkes Werkzeug.

2. Fragmentierungsstrategie entsprechend anpassen.

Kurze Reads → engere Fragmentierungskontrolle; lange Reads → sanftes Scheren oder minimale Fragmentierung.

3. Adapter und Barcodes separat validieren.

Führen Sie kleine Testligationen und Qualitätskontrollen durch, um die Effizienz der Adapter zu bestätigen, bevor Sie die Skalierung vornehmen.

4. Verwenden Sie konsistente QC-Standards über alle Plattformen hinweg..

Überprüfen Sie vor der Sequenzierung die Verteilung der Bibliotheksgröße, die Molarität und die Dimerlevels – diese Kennzahlen beeinflussen sowohl die Leistung von Illumina als auch von ONT.

5. Link zur QC-Ressource

Für Details zu QC-Metriken (Größenverteilung, Molarität, Dimerquoten) siehe Qualitätskontrolle vor der Sequenzierung: Sicherstellung der Datenintegrität.

Bibliotheks-QC und Quantifizierung: Sicherstellung der Datenintegrität

Die Qualitätskontrolle und die genaue Quantifizierung Ihrer finalen NGS-Bibliothek sind entscheidend, um erfolgreiche Sequenzierungsdurchläufe zu gewährleisten. Fehler an dieser Stelle führen zu Unter- oder Überclusterung (bei Illumina), verschwendeten Reads oder nicht reproduzierbarer Tiefe. Im Folgenden sind die wichtigsten QC-Schritte, Methoden und Best Practices aufgeführt.

8.1 Warum QC und Quantifizierung wichtig sind

• Die Chemie des Sequenzierers (insbesondere Illumina) erwartet, dass Bibliotheken so sind geladen mit präziser Molarität um eine optimale Cluster-Dichte zu bilden. Ungenaue Quantifizierung ist die Hauptursache für schlechte Laufleistung (Unterladung oder Überfüllung).
• QC-Methoden, die nur die gesamte DNA messen (z. B. Spektrophotometrie), können Überschätzung nutzbarer Bibliotheksmoleküle, da sie adapterfreie Fragmente, Primer-Dimere oder Fragmente mit einem einzelnen Adapter zählen.
• Die Kombination komplementärer QC-Techniken (Größenverteilung + Quantifizierung von Adapter-ligierten Molekülen) bietet das beste Vertrauen.

Praktische Hinweise & Beste Praktiken

• Benutzen Dreifachmessungen und mehrere Verdünnungen in der qPCR, um Pipettier- oder Amplifikationsbias zu reduzieren.
• Immer einfügen a positive Kontrolle/Referenzbibliothek mit bekannter Molarität in qPCR-Läufen.
• Für dPCR zählen Sie nur die Partitionen, die für beide Adapter-Primer-Sonden (P5 und P7) doppelt positiv sind, um die korrekte Anzahl der sequenzierungsfähigen Moleküle zu erhalten.
• Mikrofluidische Systeme verwenden, um inspektieren Sie die Form des Peaks der BibliothekIdentifizieren Sie Adapter-Dimer-Spitzen (z. B. um 120–140 bp) oder unerwartete Größenverteilungen.
• Bibliotheken basierend auf normalisieren Molarität, nicht Masse, beim Pooling für Multiplex-Sequenzierung, um eine gleichmäßige Abdeckung zwischen den Proben zu gewährleisten.

8.2 QC- und Quantifizierungsmethoden: Stärken und Einschränkungen

8.3 QC-Kriterien & Warnsignale

• Adapter-Dimer-Fraktion sollte minimal sein (< 1–2 % idealerweise). Ein ausgeprägter Dimerpeak ist ein Warnsignal.
• GipfelformDer Hauptbibliotheksgipfel sollte glatt und symmetrisch sein; "Schultern", multiple Gipfel oder breite Schwänze deuten auf Fragmentierung oder Inkonsistenzen bei der Ligation hin.
• GrößendurchmesserbreiteEine zu breite Verteilung kann die Lesereinheitlichkeit oder die Überlappungseffizienz verringern.
• qPCR- oder dPCR-EffizienzmessungenWenn die Steigung der Standardkurve oder die dPCR-Partitionierungsmetriken abweichen, überprüfen Sie die Primer, Standards oder Probenverdünnungen erneut.
• Abweichungen zwischen den MethodenWenn der fluorometrische Wert viel höher ist als der qPCR-Wert, vermuten Sie nicht-ligiertes DNA / Primer-Dimere.
• Niedrige Molarität vs. ZielbeladungWenn die Molarität nach der Qualitätskontrolle zu niedrig für die optimale Beladung des Sequenziergeräts ist, müssen Sie möglicherweise eine Re-Amplifikation durchführen (während Sie das Risiko von Artefakten abwägen).

8.4 Beispiel Fallstudie

In einem vergleichenden Workflow bereitete ein CRO Illumina-Bibliotheken aus DNA mit niedrigem Input vor. Eine Standard-Qubit-Messung deutete auf etwa 10 nM hin, aber qPCR zeigte nur etwa 4 nM nutzbare Bibliothek an. Da das Labor nur dem qPCR-Ergebnis vertraute, passten sie die Beladung entsprechend an und vermieden eine Überclusterung, wodurch sie qualitativ hochwertige Daten mit über 95 % der Cluster, die die Filter bestanden, erzielten.

Ein weiteres veröffentlichtes Werk umgesetzt digitale PCR-Quantifizierung von Low-Input-Bibliotheken und zeigte, dass dPCR die Sequenzerausbeute besser vorhersagte als konventionelles qPCR, insbesondere bei sub-nanomolaren Bibliothekskonzentrationen (White et al., 2008).

Abb. 2. Ein Schema des universellen Templates (UT) PCR-Assays.

Fehlerbehebung bei häufigen Problemen bei der Bibliotheksvorbereitung

Selbst bei gut gestalteten Protokollen kann die Bibliotheksvorbereitung fehlschlagen oder unterdurchschnittlich abschneiden. Im Folgenden finden Sie einen strukturierten Leitfaden zur Fehlersuche, um häufige Probleme bei der NGS-Bibliotheksvorbereitung zu diagnostizieren und zu beheben.

9.2 Praktische Tipps und Präventionsmaßnahmen

• Sei streng bei der Einhaltung des Protokolls..

Geringfügige Abweichungen (z. B. Mischmethode, Inkubationszeit) verursachen unverhältnismäßige Effekte. Viele manuelle Vorbereitungsfehler resultieren aus Selbstzufriedenheit oder "Protokollabweichung."

• Verwenden Sie Mastermischungen und konsistente Aliquotierung..

Das Zusammenfassen standardisierter Reaktionskomponenten reduziert Pipettierfehler und verbessert die Reproduzierbarkeit.

• Reagen pro Charge validieren.

Enzymmengen können variieren. Kontrollreaktionen oder Validierungsbibliotheken beim Wechseln der Kits.

• Halten Sie einen sauberen, kontaminationsbewussten Arbeitsplatz..

Kreuzkontamination durch Reagenzien, Aerosole oder Probenübertragung kann die Integrität der Bibliothek beeinträchtigen. Verwenden Sie gefilterte Pipettenspitzen, UV-Dekontamination und die Handhabung von Einzelproben, wenn möglich.

• Optimieren Sie die Perlenreinigung sorgfältig..

Das Verhältnis von Perlen zu Probe, das Mischen und die Trocknungszeit sind entscheidend. Über- oder Untertrocknen der Perlen oder eine falsche Einschätzung der Ethanolreinheit können zu erheblichen Verlusten in der Bibliothek führen.

• Pilotieren Sie Kleinserientests vor vollständigen Chargenläufen.

Führen Sie immer eine kleine Testbibliothek durch, um die Fragmentierung, Ligation und Reinigung zu überprüfen, bevor Sie hochskalieren.

• Interne Kontrollen / Spike-Ins einbeziehen

Eine Referenzkontrollbibliothek oder ein bekanntes Standard hilft, systemische Fehler zu identifizieren.

Best Practices und Automatisierungstrends in der Bibliotheksvorbereitung

Mit der Skalierung von NGS in Forschungs- und CRO-Umgebungen wird die manuelle Bibliotheksvorbereitung zu einem Engpass in der Durchsatzkapazität. Automatisierung und bewährte Verfahren helfen Laboren, die Reproduzierbarkeit zu erhöhen, Fehler durch manuelle Eingriffe zu reduzieren und das Personal zu entlasten, damit es sich auf wertschöpfendere Aufgaben konzentrieren kann.

10.1 Warum Automatisierung – Wichtige Vorteile für CROs / Forschungsinstitute

• Konsistente ReproduzierbarkeitAutomatisierte Flüssigkeitshandler reduzieren die Pipettierabweichung und gewährleisten einheitliche Reaktionsbedingungen über die Wells und Durchläufe hinweg.
• Reduzierte praktische Zeit und menschliche FehlerAutomatisierte Workflows reduzieren mühsame manuelle Schritte und minimieren Fehler wie Reagenzmischungen oder Pipettierfehler.
• SkalierbarkeitMit dem wachsenden Bedarf an Sequenzierung ist die Einstellung von Personal weniger effizient als die Automatisierung. Die NEBNext-Reagenzien von NEB sind für eine nahtlose Integration in robotergestützte Systeme konzipiert.
• Reagenabfall reduzieren und Konsistenz erhöhenPräzise Dosierung ermöglicht die Miniaturisierung von Reagenzien, weniger Totvolumen und eine konsistente Leistung.
• Protokollstandardisierung und PrüfbarkeitAutomatisierte Workflows können genau dokumentiert und versioniert werden, um die Qualitätssicherung in CRO-Umgebungen zu unterstützen.

10.2 Aktuelle Automatisierungsplattformen und -ansätze

Robotergestützte Flüssigkeitshandhabungssysteme

• Zu den gängigen Plattformen gehören Beckman Coulter (Biomek), Hamilton (NGS STAR), Tecan, Eppendorf und Agilent Bravo. Viele Reagenzien- und Kit-Anbieter zertifizieren oder unterstützen Automatisierungsskripte für diese Plattformen.

Anbieter-validierte Automatisierungsprotokolle

• Zum Beispiel bietet Illumina "Illumina Qualified Methods" für die Bibliotheksvorbereitung auf Partnerautomatisierungsplattformen an.
• NEBNext-Kits sind speziell für die Automatisierungskompatibilität optimiert (reduzierte Pipettier-Schritte, Reagenzstabilität über Volumina hinweg).

Mikrofluidik und miniaturisierte Systeme

• Einige mikrofluidische Geräte und kompakte Robotik zielen darauf ab, die Bibliotheksvorbereitung in Formaten mit geringeren Volumina (z. B. 96-Well, Nanoliter-Skala) zu automatisieren.

Open-Source-/Modulare Plattformen

• Robotersysteme wie Opentrons (Flex, OT-2) werden zunehmend in NGS-Workflows eingesetzt. Zum Beispiel ist das QIAseq FX-Kit auf Opentrons validiert.

Integrierte Tischsysteme

• Einige Systeme bündeln die Bibliotheksvorbereitung, die Zielerfassung und die Qualitätskontrolle in einem kompakten Format – z. B. Agilents Magnis NGS-Vorbereitungssystem, Bravo NGS.

10.3 Beste Praktiken für die Einführung von Automatisierung, ohne die Qualität zu opfern

Beginnen Sie mit Kleinserien-Pilotläufen.

• Testautomatisierungsskripte auf einer Teilmenge von Proben, Vergleich der manuellen vs. automatisierten Bibliotheksmetriken (Ertrag, Größenverteilung, Dimerquoten).

Validierung über Reagenzienchargen und Probenarten hinweg

• Die Automatisierung kann geringfügige Schwankungen zwischen den Chargen oder subtile Unterschiede zwischen den Proben verstärken. Validieren Sie immer erneut, wenn sich Reagenzien, Bead-Chargen oder Probenarten ändern.

Optimierung von Totvolumen und Mischschritten

• Da die Automatisierung empfindlicher auf Totvolumina reagiert, stellen Sie sicher, dass die Reagenzien mit ausreichendem Überschuss bereitgestellt werden und das Mischen auf dem Deck effizient ist.

Überwachen und kalibrieren Sie das Pipettieren regelmäßig.

• Die robotergestützte Pipettierung muss für unterschiedliche Viskositäten oder Reagenztypen (z. B. Enzyme vs. Puffer) kalibriert werden.

Integrieren Sie Qualitätskontrollen an Deck.

• Falls möglich, integrieren Sie die Qualitätskontrolle (z. B. Fluoreszenzmessungen, Mischverifizierung) während des Prozesses, um Fehler frühzeitig zu erkennen.

Modularität beibehalten

• Stellen Sie sicher, dass Ihr System mehrere Protokolle (DNA, RNA, gezielte Erfassung) unterstützt, damit die Wiederverwendbarkeit der Werkzeuge maximiert wird.

Protokolle verfolgen und versionieren

• Verwenden Sie Softwarekontrolle (LIMS oder Protokollversionierung), damit jeder Durchlauf protokolliert, reproduzierbar und prüfbar ist.

Plan für Wartung und Unterstützung

• Mechanischer Verschleiß, Spitzenausrichtung, Deckenkontamination und Software-Updates müssen proaktiv verwaltet werden.

10.4 Aufkommende Trends & Zukünftige Richtungen

Reaktionsminiaturisierung

• Kleinere Volumina (z. B. sub-mikrofluidisch) reduzieren den Reagenzienverbrauch und die Kosten pro Bibliothek.

Adaptive/ intelligente Robotik

• Robotersysteme, die Reagenzvolumina, Viskosität oder Pipettierdruck erfassen und dynamisch anpassen.

Geschlossener Regelkreis und Fehlermeldung

• Echtzeitsensoren oder Kameras, die Flüssigkeitsstände, Blasenbildung oder die Integrität von Pipettenspitzen überwachen und sich dynamisch anpassen.

Integration mit upstream/downstream Automatisierung

• Die Verknüpfung von Extraktion, Bibliotheksvorbereitung, Anreicherung und Sequenzierung in kontinuierlichen Pipelines reduziert Übergaben und Verzögerungen.

Standardisierung über Labore hinweg

• Da immer mehr Labore Automatisierung übernehmen, wird das Teilen validierter Protokolle, gemeinschaftlicher Skripte und Benchmark-Datensätze die Reproduzierbarkeit zwischen den Laboren beschleunigen.

Automatisierung für neuartige Bibliotheksarten

• Langzeitlese-, Einzelzell-, Spatial-Omics-, Ultra-Niedrig-Eingangs- und maßgeschneiderte Barcode-Bibliotheksmethoden werden neue Automatisierungsparadigmen erfordern.

Schlussfolgerung

Zusammenfassend, Die Bibliotheksvorbereitung ist der Schlüssel. eines erfolgreichen NGS-Sequenzierungs-Workflows. Über "einen weiteren Schritt" hinaus verwandelt es rohes DNA oder RNA in sequenzierungsbereite Moleküle. Wenn irgendein Unter Schritt – Fragmentierung, Endreparatur, Adapterligatur, Amplifikation oder Qualitätskontrolle – schlecht ausgeführt wird, kann der gesamte Lauf unter niedrigem Ertrag, hoher Duplizierung, ungleichmäßiger Abdeckung oder völliger Fehlfunktion leiden.

Für CROs, akademische Labore und Forschungsgruppen, die Durchsatz, Zuverlässigkeit und Kosteneffizienz maximieren möchten, sind die Strategien, die wir behandelt haben, umsetzbare Hebel:

• Fragmentierung optimieren um die Einfügegröße zu steuern und Verzerrungen zu reduzieren
• Feinabstimmung Endreparatur / A-Tailing um die Ligationseffizienz zu verbessern
• Balance-Adapter-Ligation—die molaren Verhältnisse, Inkubation und Reinigung richtig einstellen
• Begrenzen Sie die Amplifikationszyklen und verwenden Sie hochpräzise Enzyme
• Implementieren Sie strenge Qualitätskontrolle / Quantifizierung. (qPCR, Kapillaranalyse, dPCR wo verfügbar)
• Automatisierung und modulare Gestaltung übernehmen Durchsatz und Konsistenz skalieren

Aufkommende Trends – miniaturisierte Reaktionen, intelligente Robotik, geschlossene Rückkopplungssysteme zur Qualitätskontrolle – versprechen weitere Fortschritte in der Reproduzierbarkeit und den Kosten pro Bibliothek. Viele Labore betrachten die Bibliotheksvorbereitung heute bereits als einen skalierbaren, prüfbaren Prozess und nicht mehr als ein handwerkliches Kunsthandwerk.

Wenn Sie Ihr nächstes NGS-Projekt planen und Hilfe bei der Auswahl des optimalen Bibliotheksvorbereitungswegs (Illumina, Nanopore oder hybrid) benötigen oder eine fachkundige Durchführung wünschen, Wir sind hier, um zu helfen.. Du kannst:

• Kontaktieren Sie unsere Spezialisten für Bibliotheksvorbereitung für eine Beratung.
• Fordern Sie eine Pilotbibliotheksvorbereitung für Ihren Proben-Typ an.
• Überprüfen Sie unsere verwandten Inhalte zu Probenvorbereitung, Sequenzierungs-Workflow, und QC vor der Sequenzierung

Lassen Sie uns hochwertige biologische Proben in hochwirksame Sequenzierungsdaten umwandeln – effizient, reproduzierbar und mit Vertrauen.

Referenzen:

1. Ribarska, T., Bjørnstad, P.M., Sundaram, A.Y.M. et al. Die Optimierung der enzymatischen Fragmentierung ist entscheidend, um die Genomabdeckung zu maximieren: ein Vergleich von Bibliotheksvorbereitungsmethoden für die Illumina-Sequenzierung. BMC Genomik 23, 92 (2022).
2. Weiß RA 3., Blainey PC, Fan HC, Quake SR. Digitale PCR bietet eine empfindliche und absolute Kalibrierung für Hochdurchsatz-Sequenzierung. BMC Genomics. 2009, 19. März;10:116. doi: 10.1186/1471-2164-10-116. Erratum in: BMC Genomics. 2009;10:541. PMID: 19298667; PMCID: PMC2667538.