Wie man ein Gen sequenziert: Schritt-für-Schritt Experimentablauf

Einführung — Was bedeutet es, ein Gen zu sequenzieren?

Genomsequenzierung ist der Prozess, die genaue Reihenfolge der Nukleotide—Adenin (A), Thymin (T), Cytosin (C) und Guanin (G)—innerhalb eines DNA-Moleküls zu bestimmen. Praktisch gesehen gibt es den Forschern das präzise genetische "Blueprint", das die Struktur und Funktion eines Gens definiert. Das Verständnis dieser Sequenz ermöglicht es Wissenschaftlern, zu untersuchen, wie Gene funktionieren, wie sie zwischen Organismen variieren und wie Mutationen biologische Prozesse beeinflussen.

In akademischen und vertraglichen Forschungslaboren ist die Gen-Sequenzierung einer der häufigsten Arbeitsabläufe, die verwendet werden, um Klonierungsergebnisse zu überprüfen, Mutationen zu identifizieren und neu entdeckte Gene zu charakterisieren. Obwohl sich die Sequenzierungstechnologien dramatisch weiterentwickelt haben – von der Sanger-Sequenzierung zu modernen Hochdurchsatz-Plattformen der nächsten Generation – bleibt die grundlegende experimentelle Logik dieselbe: extrahieren, amplifizieren, reinigen und die Sequenz lesen.

Die Befolgung eines systematischen Arbeitsablaufs ist entscheidend, um zuverlässige und interpretierbare Ergebnisse zu erzielen. DNA von schlechter Qualität, suboptimale Primer oder unzureichende Reinigung können zu unlesbaren Chromatogrammen oder rauschhaften Daten führen, was Zeit und Reagenzien verschwendet. Durch das Verständnis jedes experimentellen Schrittes in der Sequenzbestimmung können Labormitarbeiter bessere Experimente entwerfen und häufige Probleme vor der Datenanalyse beheben.

Da dieser Leitfaden erklärt, wie die Schritt-für-Schritt-Experimenteller Arbeitsablauf zur Sequenzierung eines Gens, es wird sich auf praktische Aspekte konzentrieren, die die Datenqualität direkt beeinflussen – insbesondere für akademische Forscher und Techniker von CROs, die routinemäßig Sequenzierungen auf Genebene durchführen. Für Hinweise zur Primer-Design können Sie auch auf unseren Begleitartikel verweisen, Wie man Primer für die DNA-Sequenzierung entwirft: Ein praktischer Leitfaden.

Schritt 1: Hochwertige DNA aus Ihren Proben extrahieren

Erfolgreiche Gen-Sequenzierung beginnt mit der Extraktion von DNA, die intakt, rein und in ausreichender Menge vorhanden ist. Schlechte DNA-Qualität ist eine häufige Ursache für fehlgeschlagene PCRs oder unlesbare Sequenzierungsergebnisse. Im Folgenden sind wichtige Praktiken, Warnhinweise und Tipps für eine zuverlässige Extraktion in Forschungs- und Auftragsforschungseinrichtungen aufgeführt.

2.1. Probenentnahme, Lagerung & Vorbehandlung

• Wählen Sie frische oder gut erhaltene Proben. Abgebautes Gewebe oder längere Frost-Tau-Zyklen verringern die DNA-Integrität.
• Für Zellen, Gewebe oder mikrobielle Kulturen, sammeln Sie zum optimalen Wachstumsstadium (z. B. ~80% Konfluenz für adhärente Zellen).
• Verwenden Sie DNA-freie, nukleasefreie Verbrauchsmaterialien (Spitzen, Röhrchen, Reagenzien), um Kontamination zu vermeiden.
• Schnellgefrieren oder bei –80 °C für die Langzeitlagerung aufbewahren; kurzfristige Lagerung kann bei 4 °C in Puffer erfolgen.
• Wenn Gewebe starr oder unflexibel sind (z. B. Pflanzen, fibrotisches Gewebe), vorhomogenisieren (zerkleinern, Perlenmischen), um eine effiziente Lyse zu unterstützen.
• Die Gewebehomogenisierung ist entscheidend, um den Ertrag zu maximieren.

2.2. Zelllyse und Inaktivierung der Nuklease

• Verwenden Sie ein Lysepuffer, der ein Detergens (z. B. SDS, Triton X-100) sowie ein chaotropes Salz (z. B. Guanidinisothiocyanat) enthält, um Membranen zu stören und Proteine zu denaturieren.
• Fügen Sie während der Lyse Proteinase K (oder ein anderes Protease) hinzu, um Proteine (einschließlich Histone und Nukleasen) abzubauen.
• Inkubieren Sie bei einer optimalen Temperatur (z. B. 55–65 °C) mit gelegentlichem Mischen, bis die vollständige Verdauung erreicht ist.
• Fügen Sie EDTA oder andere Chelatoren hinzu, um zweiwertige Ionen zu sequestrieren und DNasen zu hemmen.

2.3. DNA-Bindung / Trennung von Verunreinigungen

Nach der Lyse müssen Sie die DNA von Proteinen, Lipiden und anderen Zelltrümmern trennen. Häufige Strategien umfassen:

• Silica-Säulen-/Membranbindung (Spin-Säulen): DNA bindet unter Hochsalzbedingungen an Silica, wird dann gewaschen und eluiert.
• Magnetische Perlen-basierte Auffangung: DNA bindet an Perlen; Magnete trennen die Perlen von der Lösung und ermöglichen Waschschritte.
• Organische Extraktion (Phenol: Chloroform): Klassische Methode, aber sie beinhaltet gefährliche Lösungsmittel und ist arbeitsintensiver.
• Fällung (Ethanol / Isopropanol + Salze): Nützlich zur Konzentration von DNA, aber weniger selektiv und riskanter für die Mitfällung von Verunreinigungen.

Bei der Auswahl einer Methode sollten die Vor- und Nachteile berücksichtigt werden: Säulen und Perlen liefern schneller sauberere DNA; die organische Extraktion kann aus schwierigen Proben mehr DNA gewinnen, wenn sie sorgfältig durchgeführt wird.

2.4. Waschen und Eluieren

• Waschschritte (z. B. 70 % Ethanol) entfernen Salze, Detergenzien und verbleibende Verunreinigungen.
• Es ist entscheidend, die Säule/Perlenpellet vollständig zu trocknen oder im Schleudergang zu entfeuchten, um verbleibenden Ethanol zu entfernen (der downstream Enzyme hemmen kann).
• Eluieren Sie DNA in einem Puffer mit niedrigem Salzgehalt (z. B. TE, Tris) oder in nukleasefreiem Wasser. Das Vorwärmen des Elutionspuffers auf ca. 50 °C kann den Ertrag verbessern.
• Verwenden Sie ein minimales Elutionsvolumen, das mit den nachfolgenden Schritten kompatibel ist, um die effektive Konzentration zu erhöhen.

2.5. Qualitätskontrolle: Ertrag, Reinheit und Integrität

Bevor Sie mit PCR und Sequenzierung fortfahren, bewerten Sie die DNA-Qualität mit:

• Spektrophotometrie (A260/A280, A260/A230): Bevorzugte Reinheitsbereiche ~1,8 (proteinfrei) und >1,8 für 260/230 (Salzverunreinigungen).
• Fluorometrische Quantifizierung (z.B. Qubit), um die genaue Konzentration von doppelsträngiger DNA zu bestimmen.
• Agarose-Gelelektrophorese: Hochmolekulare Bänder visualisieren; Abbau oder Schmier nachweisen.
• Optional: Kapillarelektrophorese oder TapeStation / Bioanalyzer für genauere Größen-/Integritätsbestimmungen.

Wenn DNA eine Zersetzung, geringe Ausbeute oder schlechte Reinheit zeigt, überprüfen Sie die Lysebedingungen, die Waschschritte oder den Umgang mit der Probe.

Schritt 2: Amplifizieren des Zielgens mittels PCR

Sobald Sie hochwertiges DNA-Material haben, besteht der nächste entscheidende Schritt darin, Ihr Zielgen selektiv durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu amplifizieren. Eine gut gestaltete, optimierte PCR ist grundlegend für saubere Sequenzierungslesungen später.

3.1. Warum PCR vor der Sequenzierung?

• PCR erhöht die Anzahl der DNA-Kopien für die Zielregion, um die Signalstärke bei der Sequenzierung zu verbessern.
• Es bereichert das korrekte Fragment inmitten eines komplexen genomischen Hintergrunds.
• Eine übermäßig komplexe Probe (z. B. genomische DNA) ohne Anreicherung führt oft zu schwachen oder mehrdeutigen Reads.

Die regulatorischen Sequenzierungsrichtlinien betonen, dass eine robuste, spezifische PCR ein wesentlicher Faktor für den Erfolg der Sequenzierung ist.

3.2. Reaktionskomponenten & Konzentrationen

Ein typisches PCR-Mix enthält:

3.3. Thermische Zyklenstrategie

Ein standardmäßiges PCR-Programm folgt oft:

• Erstdenaturierung (~95 °C, 2 min) — vollständige Denaturierung der Template-DNA.
• Denaturierungsschritt in jedem Zyklus (95 °C, 15–30 s)
• Anlaufphase (Tm – ~5 °C, ~15–30 s) — Primer binden an das Ziel.
• Erweiterungsschritt (typischerweise 68–72 °C, ~1 min pro kb)
• Abschließende Erweiterung (68–72 °C, 5–10 min) — gewährleistet eine vollständige Verlängerung.
• Bei 4 °C lagern.

Wenn Ihr Ziel eine hohe GC-Haltigkeit oder Sekundärstrukturen aufweist, ziehen Sie eine Touchdown-PCR in Betracht – beginnen Sie mit der Annealung bei einer höheren Temperatur und senken Sie diese mit jedem Zyklus allmählich, um die Spezifität zu verbessern.

3.4. Auswahl der Polymerase und Bedenken hinsichtlich der Genauigkeit

• Verwenden Sie eine hochgenaue Polymerase (Proofreading), um die Fehlerquoten in Ihrem Amplicon zu minimieren, insbesondere wenn die nachgelagerte Sequenzierung empfindlich auf Fehlpaarungen reagiert.
• Einige Polymerasen sind darauf ausgelegt, AT- oder GC-reiche Regionen zu amplifizieren. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass Phusion Plus extrem AT-reiche Vorlagen (bis zu 90 % AT) bei entsprechender Optimierung amplifizieren kann.
• Beim Amplifizieren von GC-reichen Vorlagen sollten Sie in Betracht ziehen, Mastermischungen mit GC-Enhancern zu verwenden oder DMSO, Betaine oder andere Zusatzstoffe hinzuzufügen, um sekundäre Strukturen zu destabilisieren.

3.5. Fortgeschrittene PCR-Strategien und Fehlersuche

• Verschachtelte PCR: nützlich, wenn die Spezifität niedrig ist. Führen Sie eine erste Runde mit äußeren Primern durch, gefolgt von einer zweiten Runde mit inneren (verschachtelten) Primern, um die Amplifikation von Off-Target zu reduzieren.
• Hot-Start-PCR: Verhindert unspezifische Primerbindung oder -verlängerung bei Raumtemperatur, indem die Polymeraseaktivität bis zum ersten Denaturierungsschritt verzögert wird. Dies erhöht die Spezifität.

Fehlerbehebungstipps:

• Wenn Sie mehrere Banden oder ein Schmiersignal sehen, erhöhen Sie die Annealing-Temperatur oder reduzieren Sie die Anzahl der Zyklen.
• Wenn keine Amplifikation erfolgt: Überprüfen Sie das Primerdesign, die Templatekonzentration oder den Magnesiumgehalt.
• Für schwache Banden: Verlängern Sie die Verlängerungszeit oder passen Sie die Polymerasekonzentration an.

Schritt 3: Reinigen Sie das PCR-Produkt für die nachfolgende Sequenzierung.

Nach der Amplifikation enthält Ihr PCR-Produkt weiterhin verbleibende Primer, freie Nukleotide (dNTPs), DNA-Polymerase, Salze und Pufferbestandteile. Diese Verunreinigungen können die Sequenzierleistung erheblich beeinträchtigen – indem sie Rauschen einführen, die Leseweite verkürzen oder Leseausfälle verursachen. Daher ist der Reinigungsschritt unerlässlich.

Im Folgenden beschreibe ich die wichtigsten Reinigungsstrategien, Vor- und Nachteile sowie praktische Tipps, um sequenzierfertige DNA zu erhalten.

4.1. Warum Reinigung wichtig ist

• Uninkorporierte Primer können falsche Sequenzierungsstarts oder Hintergrundpeaks erzeugen.
• Überschüssige dNTPs stören das Verhältnis zwischen dNTPs und markierten Terminator-Nukleotiden (bei der Sanger-Sequenzierung), was die Signalqualität verringert.
• Rückstands-Polymerasen oder Puffersalze können Sequenzierungsenzyme hemmen oder die Lesegenauigkeit verringern.
• Wenn nur ein einzelnes sauberes PCR-Produktband vorhanden ist, ist eine einfachere Reinigung oft ausreichend; wenn mehrere Bänder erscheinen, ist die Gelreinigung sicherer.

4.2. Häufige Reinigungsmethoden

Im Folgenden sind häufig verwendete Reinigungsstrategien aufgeführt, mit vergleichenden Anmerkungen.

4.3. Praktische Tipps & Best Practices

• Wählen Sie die Methode basierend auf der Spezifität der PCR: Wenn Ihre PCR ein einzelnes sauberes Band ergibt, ist die enzymatische oder Säulenreinigung am schnellsten und sichersten. Wenn mehrere Bänder erscheinen, verwenden Sie die Gel-Extraktion, um das richtige Fragment zu isolieren.
• Kontrollieren Sie das Elutionsvolumen im Vergleich zur Konzentration: Verwenden Sie ein minimales Elutionsvolumen (z. B. 20–30 µL), um eine ausreichende Konzentration für die Sequenzierung aufrechtzuerhalten.
• Trocknen Sie die Perlen oder Spin-Säulen gut: Restliches Ethanol aus Waschpuffern kann die Sequenzierungsenzyme (insbesondere Polymerasen) hemmen.
• Vorwärmen des Elutionspuffers (~50 °C), um die DNA-Rückgewinnung zu erhöhen.
• Validieren Sie das gereinigte Produkt auf Gel oder durch Spektrophotometrie, um das Fehlen von Primer-Dimeren oder Schmiere zu gewährleisten.
• Für enzymatische Aufräumprotokolle:

    Ein typisches ExoI + SAP-Protokoll von Thermo Fisher verwendet ~5 µL PCR-Produkt + 0,5 µL ExoI + 1 µL SAP, inkubiert bei 37 °C für 15 Minuten, dann 85 °C für 15 Minuten zur Inaktivierung.

• Optimieren Sie das Verhältnis von Perlen (für SPRI-Methoden): Passen Sie das Verhältnis von Perlen zu Reaktionsvolumen an, um kleinere Fragmente (z. B. Primer-Dimere) auszuschließen und gleichzeitig das vollständige Amplicon zu erhalten.
• Minimieren Sie die UV-Belastung: Verwenden Sie während der Gel-Extraktion minimale UV-Intensität oder Blau-Licht-Transillumination, um DNA-Schäden zu reduzieren.

Schritt 4: Wählen Sie eine Gen-Sequenzierungsmethode aus

Sobald Ihr PCR-Produkt sauber ist, besteht die nächste Entscheidung darin, welches Sequenzierungstechnologie ist geeignet für Ihr Ziel. Diese Wahl hat direkte Auswirkungen auf Kosten, Durchsatz, Leselänge, Genauigkeit und nachgelagerte Arbeitsabläufe. Unten finden Sie einen Vergleich der Hauptoptionen und Hinweise zur Auswahl der richtigen Methode für die Genebene-Sequenzierung.

5.1. Sanger-Sequenzierung (Kapillar- / Dideoxy-Methode)

Wie es funktioniert (kurz):

• Die klassische Dideoxy-Terminierungschemie verwendet fluoreszenzmarkierte ddNTPs, um die DNA-Strangverlängerung an jeder Basenposition zu beenden.
• Fragmente, die sich durch einzelne Nukleotide unterscheiden, werden durch Kapillarelektrophorese getrennt; Detektoren zeichnen die Fluoreszenz auf, um die Basenreihenfolge abzuleiten.
• Typischerweise liefert es Lese-Längen von bis zu ~800–1.000 bp (nutzbarer Bereich ~500–800 bp).

Stärken:

• Sehr hohe Basisgenauigkeit (häufig > 99,9 %)
• Einfache Datenausgabe (Chromatogramme mit minimalen Rechenanforderungen)
• Ideal zum Verifizieren einzelner Gene oder kleiner Zielmengen.
• Minimale Infrastrukturkosten im Vergleich zu Hochdurchsatzsystemen

Einschränkungen:

• Geringer Durchsatz (ein Fragment pro Reaktion) — nicht kosteneffektiv bei der Skalierung auf viele Gene
• Die Obergrenzen der Leselängen werden für längere Amplicons oder komplexe Regionen verwendet.
• Die Sensitivität für Varianten mit geringer Häufigkeit ist bescheiden (die Erkennung seltener Allele ist schwierig).

Best-Nutzungsszenarien:

• Validierung von Variantenaufrufen aus Hochdurchsatzdaten
• Bestätigung von Plasmid-Inserts oder klonierten Genkonstrukten
• Projekte mit wenigen Amplicons, bei denen die Einrichtungskosten niedrig bleiben müssen.

5.2. Next-Generation Sequencing (NGS / Massiv parallele Sequenzierung)

Überblick & Prinzip:

NGS-Methoden sequenzieren viele DNA-Fragmente in massiv parallel Mode, die gleichzeitige Lesevorgänge über Tausende oder Millionen von Amplicons zu ermöglichen.

Zu den gängigen NGS-Typen gehören Sequenzierung durch Synthese (Illumina), Ionensemiconductor (Ion Torrent) und Einzelmolekül. Langzeit-Leseplattformen (PacBio, Oxford Nanopore).

Vorteile:

• Hoher Durchsatz: Viele Gene oder Proben können in einem Durchgang multiplexiert werden.
• Tiefe Abdeckung: unterstützt die empfindliche Erkennung von Niedrigfrequenzvarianten
• Flexible Maßstab: geeignet für Panel-, Amplicon- oder sogar kleine Genomsequenzierung
• Geringere Kosten pro Basis beim Skalieren

Herausforderungen und Kompromisse:

• Kurze Leselängen (für viele Plattformen) können die Zuordnung in sich wiederholenden oder strukturell komplexen Regionen erschweren.
• Erfordert eine Bibliotheksvorbereitung (hier nicht behandelt)
• Der Aufwand für Datenverarbeitung und Bioinformatik ist größer.
• Fehler (insbesondere systematische) müssen durch Qualitätskontrolle und Tiefe gemindert werden.

Bemerkenswertes Fallbeispiel:

In einer Studie zum Fuß- und Mundkrankheitsvirus entdeckte NGS niedrigfrequente Varianten, die mit <1% in der Viruspopulation vorhanden waren – Varianten, die mit der Sanger-Sequenzierung übersehen worden wären.

5.3. Langzeit-/Einzelmolekül-Sequenzierung

Obwohl oft im Kontext von Genomgrößen gedacht, können Long-Read-Plattformen manchmal auch auf die Gen-Sequenzierung angewendet werden, insbesondere wenn strukturelle Variationen oder sich wiederholende Domänen beteiligt sind.

• PacBio / SMRT-Sequenzierung: erzeugt Reads von mehreren Kilobasen mit relativ hoher Konsensgenauigkeit nach der Fehlerkorrektur
• Oxford Nanopore: kann sehr lange Reads generieren, ist flexibel und unterstützt die Echtzeit-Basiskallierung.

Diese Methoden helfen, schwierige Regionen (z. B. Wiederholungen, GC-reiche Bereiche) oder die Phasierung von Varianten über ein Molekül hinweg zu lösen.

Eine Studie zur Assemblierung mikrobieller Genome hat ergeben, dass Einzelmolekül-Langlesungen die Komplexität der Assemblierung verringerten und Lücken schlossen, die mit Kurzlesungen nicht behoben werden konnten.

5.4. Entscheidungsmatrix: Welche Methode passt zu Ihrem Projekt?

Praktische Empfehlungen:

• Wenn Sie nur ein oder wenige Gene sequenzieren müssen, ist Sanger zuverlässig und kosteneffizient.
• Für Projekte mit mehreren Genen, Gen-Panels oder multiplexierten Proben bietet NGS eine hohe Skalierbarkeit.
• Wenn Ihr Gen stark repetitive Motive enthält oder Sie langreichweitige strukturelle Variationen erfassen möchten, sollten Sie Long-Read-Sequenzierung in Betracht ziehen.
• Sie können auch einen hybriden Ansatz wählen: z. B. eine breite Sequenzierung mit NGS und die Validierung spezifischer Varianten mit Sanger.

Schritt 5: Analysieren und Validieren von Sequenzierungsdaten

Nachdem Sie rohe Sequierungsdaten (z. B. Chromatogramme, FASTQ-Dateien) erhalten haben, besteht die nächste Phase darin, die Qualität zu überprüfen, die korrekte Sequenz zu bestimmen und zu bestätigen, dass das Ergebnis tatsächlich Ihr Zielgen repräsentiert. Schlechte Analysen oder unkontrollierte Fehler können Ihre Schlussfolgerungen in die Irre führen. In diesem Abschnitt erläutere ich die besten Praktiken für die Validierung von Sequenzen sowohl bei Sanger- als auch bei NGS-basierten Methoden.

6.1. Sanger-Sequenzierung: Bewertung von Elektropherogrammen und Basenaufrufen

Für die Sanger-Sequenzierung ist die Hauptausgabe ein Chromatogramm (.ab1 oder ähnlich), die Spitzen der Fluoreszenz über den Basenpositionen zeigen. Wichtige Überprüfungen umfassen:

• Spitzenauflösung und Abstände: Idealerweise gut aufgelöste, symmetrische Spitzen ohne überlappende Schwänze.
• Basisrauschen: Minimales Hintergrundsignal zwischen den Spitzen weist auf eine saubere Lesung hin.
• Phasierung und Abfall: Im Laufe der Zeit kann das Signal abnehmen; die Qualität sinkt oft nach etwa 700–900 Basen (Best Practices des RTSF Genomics Core).
• Qualitätswerte / Vertrauensanrufe: Viele Zuschauer zeigen Phred-ähnliche Qualitätswerte für jede Base an; kennzeichnen Sie Positionen mit niedrigerer Qualität (z. B. < Q20).
• Mehrdeutige oder doppelte Spitzen: Gemischte oder überlappende Spitzen können Heterozygotie, Kontamination oder Sekundärstrukturen widerspiegeln.
• Richtungswiederholungsprüfung: Sequenzieren Sie immer sowohl von den Vorwärts- als auch von den Rückwärtsprimern, wenn möglich, insbesondere in kritischen Regionen.

Wenn Basenaufrufe mehrdeutig oder von geringer Zuverlässigkeit sind, überprüfen Sie diese manuell und ziehen Sie in Betracht, die Sequenzierung zu wiederholen oder alternative Primer zu entwerfen.

Die Richtlinien der Association for Clinical Genomic Science (ACGS) betonen konsistente Kriterien für die Klassifizierung von Varianten, das Kennzeichnen unsicherer Basen und die Berichterstattung über die Zuverlässigkeit (obwohl ihr Kontext klinisch ist, sind die Prinzipien dennoch relevant für rigorose Forschungsanwendungen).

Beispiel: Der RTSF Genomics Core veröffentlichte kontrastierende "gute vs schlechte" Chromatogramme, um zu zeigen, wie falsche Konzentrationen von Vorlagen oder Primern die Daten beeinträchtigen.

6.2. NGS / Hochdurchsatz-SequenzierungQC, Ausrichtung & Variantenaufruf

Bei der Verwendung von NGS oder massiv paralleler Sequenzierung ist die Analysepipeline komplexer. Die Hauptphasen sind:

Qualitätskontrolle (QC) von Rohdaten (FASTQ)

• Adaptersequenzen trimmen, qualitativ minderwertige Enden entfernen und Reads unterhalb der Längen-Schwelle entfernen.
• Bewerten Sie die Basisqualitätsverteilungen (z. B. über FastQC oder ähnliche Tools).
• Filter oder kennzeichnen Sie Reads mit übermäßigen N-Basen oder niedriger Komplexität.

Ausrichtung / Zuordnung zu einem Referenzwert

• Karten werden auf ein Referenzgen oder Genom mithilfe von Tools wie BWA, Bowtie2 oder minimap2 abgebildet.
• Berücksichtigen Sie Mismatches, Indels und Mapping-Qualitätswerte (MAPQ).

Konsenssequenz / Variantenaufruf

• Kollationieren Sie ausgerichtete Reads und leiten Sie eine Konsensusbasis an jeder Position ab (für Amplicon-Sequenzierung).
• Rufen Sie Einzel-Nukleotid-Varianten (SNVs) oder Indels mit Varianten-Caller (z. B. GATK, FreeBayes, DeepVariant) auf.
• Filtervarianten nach Parametern wie Tiefe (DP), Allelfrequenz (AF), Basisqualität (QUAL), Strangbias und Mapping-Score.

Validierung und Überprüfung

Bei unsicheren Positionen oder Allelen mit niedriger Frequenz sollte eine Überprüfung mit Sanger-Sequenzierung (orthogonale Bestätigung) erfolgen. Viele Labore verwenden Sanger, um 1–2 % der Variantenaufrufe oder mehrdeutigen Ergebnisse zu validieren.

Beachten Sie, dass in der Literatur die pauschale Anforderung an die Sanger-Validierung diskutiert wird; eine Studie zeigte, dass eine einzige Runde der Sanger-Analyse häufiger einen echten positiven NGS-Befund fälschlicherweise widerlegen kann, als dass sie falsch-positive Ergebnisse (d.h. falsch-negative) identifiziert.

In einem Kontext der Ganzgenomsequenzierung fand eine aktuelle Studie zu 1.756 Varianten eine Übereinstimmung von etwa 99,72 % zwischen WGS und Sanger, als hohe Qualitätsgrenzen (QUAL ≥ 100, DP ≥ 20, Allelfrequenz ≥ 0,2) angewendet wurden.

Der sich verändernde Konsens ist, dass Labore etablieren sollten interne Qualitätsgrenzen Für welche Varianten ist eine orthogonale Bestätigung erforderlich, anstatt alles immer zu bestätigen?

Überprüfung & Manuelle Kuratierung

• Überprüfen Sie manuell die Variantenaufrufe in einem Genom-Viewer (z. B. IGV), insbesondere in der Nähe von Indels, Homopolymeren oder Zonen mit geringer Abdeckung.
• Kennzeichnen Sie Regionen mit geringer Abdeckung oder mehrdeutiger Zuordnung zur Vorsicht oder für eine erneute Sequenzierung.

6.3. Häufige Fallstricke & Tipps zur Qualitätskontrolle

• Niedrige Abdeckung / Tiefe: Wenn die Lesetiefe zu niedrig ist, sind Variantenaufrufe unzuverlässig – streben Sie > 20× Abdeckung bei Amplicon-Sequenzierung an.
• Strand-Bias / Richtungs-Bias: Wenn die meisten Reads, die eine Variante unterstützen, von einem Strang stammen, kann das auf ein Artefakt hindeuten.
• Variantallelfrequenz (VAF) Schwellenwert: Bei klonalen Genen sollte die VAF nahe ~100 % liegen; bei gemischten oder heterozygoten Proben ist mit ~50 % zu rechnen. Sehr niedrige VAF (< 5 %) signalisiert häufig Rauschen.
• Anruferinkonsistenzen: Verwenden Sie mehr als einen Variantenanrufer oder Konsensfilterung, um falsch-positive Ergebnisse zu reduzieren.
• Fehleranfällige Regionen: Homopolymere, GC-reiche Abschnitte und sekundäre Strukturmotive können zu Fehlinterpretationen führen – mit Vorsicht interpretieren.
• Batch-Effekte und Index-Hopping (bei multiplexiertem NGS): Achten Sie auf Probenkreuzkontamination oder Barcode-Fehlzuweisungen.

Praktische Tipps – Vermeidung häufiger Fehler bei der Genomsequenzierung

Selbst mit einem soliden Arbeitsablauf können kleine Fehler oder Versäumnisse Ihre Sequenzierungsdaten beeinträchtigen. Hier sind erfahrungsbasierte Tipps und bewährte Praktiken, um Fehler zu reduzieren, Erfolgsquoten zu steigern und die Reproduzierbarkeit aufrechtzuerhalten.

7.1. Arbeiten mit sauberen Techniken und Kontrollen

• Trennen Sie die Arbeitsbereiche für Vor- und Nach-PCR-Schritte, mit speziellen Pipetten, Handschuhen und Verbrauchsmaterialien.
• Verwenden Sie Filterspitzen (Aerosol) bei jedem Pipettier-Schritt, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
• Fügen Sie immer negative Kontrollen (ohne Vorlage) während PCR- und Sequenzierungsreaktionen hinzu.
• Für kritische Proben führen Sie technische Replikate oder Replikat-Sequenzierungen durch, um die Konsistenz zu bestätigen.

7.2. Optimierung der Template- und Primerkonzentrationen

• Zu viel Template kann in Sanger-Chromatogrammen zu Pull-Up-Peaks oder Signalsättigung führen. Eurofins warnt, dass übermäßiges Template eine bekannte Ursache für verzerrte Peaks ist (z. B. "sehr starke Signale und Pull-Up-Peaks").
• Zu wenig Vorlage führt oft zu schwachen Signalen oder unleserlichen Spuren.
• Die Primerkonzentration sollte ausgewogen sein – ein Übermaß an Primern kann Primer-Dimer-Artefakte erzeugen, während zu wenig die Ausbeute verringert.
• Entwerfen Sie Primer neu, wenn überlappende Bindungen, sekundäre Strukturen oder Off-Target-Bindungen auftreten.

7.3. Minimierung von durch PCR eingeführten Artefakten

• Bevorzugen Sie hochfidelity, proofreading Polymerasen, um Fehlinkorporationen und Indels zu reduzieren.
• Begrenzen Sie die Zykluszahl, um Überverstärkung zu vermeiden, die unspezifische Produkte und Fehlerakkumulation erhöht.
• Verwenden Sie Hot-Start-Polymerasen, um vorzeitige Verlängerung und unspezifische Amplifikation bei Raumtemperatur zu verhindern.
• Für GC-reiche oder strukturanfällige Regionen fügen Sie Co-Lösungsmittel (z. B. DMSO, Betaine) oder spezielle Puffer hinzu.
• Vermeiden Sie die "Chimärenbildung" in Multiplex- oder Hochzyklus-PCRs, da diese fusionierte oder irreführende Amplicons erzeugen können.

7.4. Überwachen und Begrenzen von Kontaminanten und Inhibitoren

• Rückstände von der DNA-Extraktion (z. B. Salze, Ethanol, Phenol) können Polymerasen hemmen – stellen Sie sicher, dass die Wasch- und Elutionsschritte gründlich sind.
• Wenn eine Hemmung vermutet wird, verdünnen Sie Ihre Vorlage oder reinigen Sie sie erneut (z. B. durch Ethanolfällung oder ein Reinigungskit).
• Verwenden Sie frisch zubereitete Reagenzien, vermeiden Sie wiederholte Gefrier- und Auftauvorgänge und entsorgen Sie alte oder verdächtige Bestände.
• Verwenden Sie ultrapures, nukleasefreies Wasser und überprüfen Sie die Puffer oder Lagerreagenzien auf Kontaminanten (z. B. Nukleasen, Nucleotide).

7.5. Wählen Sie den richtigen Sequenzierungsprimer und die richtige Strategie

• Der Primer, der in der Sequenzierung verwendet wird ("Zyklussequenzierungsprimer"), kann sich von PCR-Primern unterscheiden – einige PCR-Primern funktionieren in linearen Sequenzierungsreaktionen schlecht.
• In Homopolymeren oder repetitiven Regionen sollten verankerte Primer in Betracht gezogen werden, die die Bindung über Wiederholungen "verriegeln" und Artefakte durch Gleiten reduzieren.
• Sequenzierung sowohl in vorwärts- als auch in rückwärts Richtung, wenn möglich, insbesondere über schwierige Motive oder mehrdeutige Basen.

7.6. Chromatogramme inspizieren und frühe Qualitätsprüfungen

• Verwenden Sie Software (z. B. Sequence Scanner, TraceViewer), um das Signal-Rausch-Verhältnis, die Spitzenauftrennung, den Basislinienabfall und Farbstoffflecken zu bewerten.
• Achten Sie auf "gemischte Peaks", ungleichmäßige Abstände oder Signalabfall – dies kann auf Kontamination, Primerprobleme oder falsches Priming hinweisen.
• Wenn ein Lesevorgang fehlschlägt oder in eine Richtung mehrdeutig ist, führen Sie eine Neusequenzierung mit einem neuen Primer durch oder passen Sie die Template-Menge an.

7.7. Dokumentieren und Protokollieren jeder Bedingung

• Immer die Chargennummern (Kit-Charge, Polymerase, Reagenzcharge) zusammen mit den genauen Bedingungen (Temperaturen, Zeiten, Konzentrationen) aufzeichnen.
• Metadaten einfügen: Probenquelle, Entnahmedatum, Lagerbedingungen.
• Im Laufe der Zeit ein laborspezifisches Fehlerprotokoll erstellen – Sie könnten Trends erkennen (z. B. bestimmte Chargen, die niedrige Erträge liefern).

Werkzeuge und Reagenzien-Checkliste

Unten finden Sie eine konsolidierte Checkliste der wesentlichen Werkzeuge, Reagenzien und Verbrauchsmaterialien für die Durchführung von Gen-Sequenzierungen mittels PCR und nachfolgender Sequenzierung. Verwenden Sie dies als schnelle Laborreferenz und als Teil Ihrer internen SOP-Dokumentation.

Fazit

Die Sequenzierung eines Gens ist eine schrittweise Reise – vom Ausgangsmaterial zu einer sauberen, validierten Sequenz. Indem Sie den Workflow (DNA-Extraktion → PCR-Amplifikation → Reinigung → Sequenzierung → Analyse) systematisch befolgen und die oben genannten praktischen Tipps anwenden, maximieren Sie den Erfolg und die Reproduzierbarkeit Ihrer Experimente.

In Forschungslabors und Auftragsforschungsinstituten (CROs) führen kleine Fehler (Kontamination, suboptimale Primer, unvollständige Reinigung) häufig zu fehlerhaften Sequenzierungsergebnissen. Durch die Durchsetzung guter Laborpraktiken, die sorgfältige Überprüfung der DNA-Qualität und die Wahl der richtigen Sequenzierungsmethode (Sanger, Kurzlese-NGS oder Langlese) können Sie die Ausfallraten reduzieren und die Datenzuverlässigkeit verbessern.

Wenn Ihr Projekt mehrere Gene, Panel-Sequenzierung umfasst oder eine tiefere Variantenempfindlichkeit oder strukturelle Einblicke erfordert, sollten Sie in Erwägung ziehen, Teile oder den gesamten Workflow an einen spezialisierten Genomik-Dienstleister auszulagern. Zum Beispiel bei CD GenomicsWir bieten umfassende Sequenzierungsdienste an – von der Proben-QC über die Sequenzierung bis hin zur bioinformatischen Auslieferung – maßgeschneidert für akademische, industrielle und pharmazeutische Kunden.

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Wenn Sie sich lieber auf Ihre Wissenschaft konzentrieren und die Ausführung der Sequenzierung Experten überlassen möchten, Kontaktieren Sie uns für eine Beratung. oder fordern Sie ein Angebot für Ihr Projekt an.

•  Um Ihr Verständnis zu vertiefen, erkunden Sie diese verwandten Artikel in unserer Inhaltsbibliothek:
• Wie man Primer für die DNA-Sequenzierung entwirft: Ein praktischer Leitfaden (Primärstrategien)
• Probenvorbereitung für hochwertige Sequenzierungsergebnisse (Best Practices für die DNA-Extraktion)
• Bibliotheksvorbereitungsstrategien für die Next-Generation-Sequenzierung (zum Skalieren von NGS-Workflows)

Lassen Sie uns Ihnen helfen, mit Zuversicht vom Muster zur Sequenz zu wechseln.

Häufig gestellte Fragen (FAQs)

Q: Wie sequenziert man ein Gen von Anfang bis Ende?

Um ein Gen zu sequenzieren, extrahieren Sie zunächst hochqualitative DNA aus Ihrer Probe, amplifizieren dann Ihre Zielregion mittels PCR, reinigen das PCR-Produkt, um verbleibende Primer und dNTPs zu entfernen, wählen eine geeignete Sequenzierungsmethode (z. B. Sanger oder NGS), senden das gereinigte Amplifikat zur Sequenzierung und validieren schließlich das Ergebnis, indem Sie Chromatogramme oder Basenaufrufe analysieren und mit Referenzausrichtungen oder orthogonalen Methoden bestätigen.

Q: Welche Faktoren beeinflussen den Sequenzierungserfolg am stärksten?

Wichtige Determinanten sind die DNA-Qualität (Reinheit, Integrität, Abwesenheit von Inhibitoren), die Spezifität und das Design der Primer, die PCR-Effizienz (richtige Reagenzien, Zyklen und Enzym), die gründliche Reinigung des Amplicons sowie die angemessene Sequierungstiefe oder Lesequalität; wenn einer dieser Schritte schwach ist, kann die endgültige Sequenz rauschhaft, mehrdeutig oder ganz fehlerhaft sein.

F: Können PCR-Produkte direkt sequenziert werden, ohne weitere Schritte?

Nur wenn der PCR-Ertrag extrem rein ist (einzelner Band ohne Primer-Dimere oder unspezifische Produkte). In den meisten realen Experimenten ist eine Reinigung unerlässlich. Unentfernte Primer, dNTPs oder Polymerase-Rückstände können die Sequenzierungschemie stören und die Lesegenauigkeit beeinträchtigen, daher ist eine Reinigung vor der Sequenzierung in der Regel zwingend erforderlich.

F: Wie wählt man zwischen Sanger-Sequenzierung und NGS für ein Gen?

Verwenden Sie Sanger, wenn Sie ein oder wenige Amplicons haben und eine sehr hohe Genauigkeit bei niedriger Durchsatzrate benötigen. Wählen Sie NGS, wenn viele Gene, viele Proben oder multiplexe Panels erforderlich sind – NGS bietet Skalierbarkeit und Tiefe, auf Kosten komplexerer Daten und Bibliotheksvorbereitung.

Primer-Walking ist eine Methode, die in der Molekularbiologie verwendet wird, um DNA-Sequenzen zu bestimmen. Dabei wird schrittweise von einem bekannten Bereich der DNA ausgehend ein Primer verwendet, um die Sequenz in benachbarte, unbekannte Bereiche zu erweitern. Diese Technik wird häufig eingesetzt, wenn die Sequenzierung von DNA-Fragmenten erforderlich ist, die zu lang sind, um sie mit herkömmlichen Methoden zu sequenzieren, oder wenn es notwendig ist, Lücken in einer Sequenz zu schließen.

Primer-Walking ist ein Verfahren, bei dem sequenzielle Primer entworfen werden, um entlang der DNA-Vorlage zu "gehen" und einen längeren Bereich abzudecken, als es ein einzelner Lesevorgang erreichen kann; nach der initialen Sequenzierung werden neue Primer neben der letzten bekannten Base entworfen, und das nächste Segment wird sequenziert, wobei iterativ fortgefahren wird, bis der gesamte Abschnitt abgedeckt ist (Wikipedia: Primer-Walking).

Q: Wie kann ich feststellen, ob mein Sequenzierungsergebnis zuverlässig ist?

Überprüfen Sie Qualitätsmetriken wie scharfe Spitzen, minimales Rauschen in Chromatogrammen für Sanger oder Lesetiefe, Basisqualitätswerte und Konsistenz der Zuordnung in NGS. Vergleichen Sie auch Ihre Sequenz mit einem vertrauenswürdigen Referenz- oder Datenbank und bestätigen Sie optional mehrdeutige oder neuartige Varianten mit einer zweiten Methode oder durch wiederholte Sequenzierung.

Q: Was ist der Unterschied zwischen der Ganzgen-Sequenzierung und der Panel- oder Exom-Sequenzierung?

Die Ganz-Gen-Sequenzierung konzentriert sich auf einen engen Bereich (das interessierende Gen) und verwendet gezielte PCR oder Capture, während die Panel-Sequenzierung eine Gruppe von Genen abdeckt und die Exom-Sequenzierung alle kodierenden Regionen über viele Gene hinweg umfasst. Der tiefere Fokus in der Gen-Sequenzierung führt in der Regel zu einer höheren Abdeckung und einfacheren Analyse-Pipelines.

A: Was soll ich tun, wenn eine Region nicht sequenziert oder mehrdeutige Ergebnisse zeigt?

Sie können Primer (insbesondere interne Primer) neu gestalten, das Amplicon in überlappende Fragmente aufteilen, die Sekundärstruktur durch Additive (z. B. DMSO) reduzieren oder alternative Sequenzierungsstrategien (z. B. Long Reads) anwenden. Das erneute Sequenzieren aus sowohl der Vorwärts- als auch der Rückwärtsrichtung hilft häufig, Mehrdeutigkeiten zu klären.

Referenz:

1. Thornton B, Basu C. Design von qPCR-Primer in Echtzeit mit kostenloser Online-Software. Biochemie und Molekularbiologie Bildung: eine zweimonatliche Veröffentlichung der Internationalen Union für Biochemie und Molekularbiologie. 2011 Mär-Apr;39(2):145-154. DOI: 10.1002/bmb.20461. PMID: 21445907.
2. Henriette O'Geen, Marketa Tomkova, Jacquelyn A Combs, Emma K Tilley, David J Segal, Determinanten der erblichen Genstilllegung für KRAB-dCas9 + DNMT3 und Ezh2-dCas9 + DNMT3 Hit-and-Run Epigenom-Editing, NukleinsäurenforschungBand 50, Ausgabe 6, 8. April 2022, Seiten 3239–3253
3. Wright CF, Morelli MJ, Thébaud G, Knowles NJ, Herzyk P, Paton DJ, Haydon DT, King DP. Jenseits des Konsenses: Zerlegung der viralen Populationsvielfalt innerhalb des Wirts des Fuß- und Mundkrankheitsvirus durch den Einsatz von Next-Generation-Sequenzierung. J Virol. 2011 Mar;85(5):2266-75. doi: 10.1128/JVI.01396-10. Epub 2010 Dez 15. PMID: 21159860; PMCID: PMC3067773.
4. Kopernik, A., Sayganova, M., Zobkova, G. u. a. Sanger-Validierung von WGS-Varianten. Wissenschaftliche Berichte 15, 3621 (2025).