Umfassende Workflows, Kernwerkzeuge und analytische Strategien für die GBS-Datenverarbeitung

Genotypisierung durch Sequenzierung (GBS), als eine effiziente und kostengünstige Vereinfachung Genomsequenzierung Technologie ist zum zentralen Mittel geworden, um die genetische Vielfalt von Pflanzen zu analysieren, die Züchtung von Nutzpflanzen zu beschleunigen und die genetischen Grundlagen komplexer Merkmale zu erforschen. Durch die Vereinfachung des Genoms können Hochdurchsatz-Sequenzierung und präzises Typing schnell genetische Marker wie massive Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNP) im gesamten Genom erhalten, was entscheidende Datenunterstützung für die Forschung in mehreren Bereichen von der Populationsgenetik bis zur molekularen Züchtung bietet.

Die durch die GBS-Technologie erzeugten großangelegten Sequenzierungsdaten (die in der Regel Zehntausende bis Millionen von Mutationsstellen und Hunderte von Proben umfassen) stellen äußerst hohe Anforderungen an die Standardisierung des Datenanalyseprozesses, die Anpassungsfähigkeit der Werkzeuge und die Zuverlässigkeit der Ergebnisse. Vom Qualitätsmanagement, der Sequenzausrichtung und der Genotypidentifikation der ursprünglichen Sequierungsdaten bis hin zur nachgelagerten Analyse der Populationsstruktur, der Genlokalisierung und der visuellen Darstellung benötigt jeder Schritt eine rigorose Auswahl der Methoden und eine Optimierung der Parameter. Gleichzeitig hebt die Interferenz komplexer Genome (wie Polyploidie), die fehlenden Daten aufgrund ungleichmäßiger Sequierungstiefe und der Rechenaufwand bei großangelegten Proben die Bedeutung der Etablierung eines effizienten Analysesystems weiter hervor.

Der Artikel beschreibt GBS-Datenanalyse-Workflows, zentrale Werkzeuge (wie TASSEL, Stacks, GATK, PLINK), Herausforderungen (ungleichmäßige Tiefe, komplexe Genome usw.) mit Lösungen, nachgelagerte Analysen und Visualisierungstools und schließt mit einer Zusammenfassung seiner Bedeutung.

Workflow und Schlüsselphasen in der GBS-Datenanalyse

GBS-Technologie wurde umfassend in der Pflanzenvererbung, dem Pflanzenzucht und Forschung zur Bevölkerungsentwicklung aufgrund seiner Vorteile von hoher Durchsatzrate und niedrigen Kosten. Der Datenanalyseprozess ist das zentrale Glied zwischen den ursprünglichen Sequenzierungsdaten und biologischen Schlussfolgerungen und erfordert eine strenge Standardisierung, um die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Der grundlegende Prozess der GBS-Datenanalyse kann in vier Schlüsselphasen unterteilt werden, die eng miteinander verbunden sind und eine vollständige Kette von der Datenerzeugung bis zur Informationsgewinnung bilden.

Die Qualitätskontrolle und die Vorbehandlung der ursprünglichen Sequierungsdaten sind der erste Schritt der GBS-Analyse, der direkt die Genauigkeit der nachfolgenden Ergebnisse beeinflusst. Die ursprünglichen Daten (normalerweise im FASTQ-Format) enthalten Sequierungssequenzen (Reads) und deren Masswerte, daher ist es notwendig, niedrigmassige Basen zu filtern, Linker-Sequenzen und wiederholte Sequenzen mithilfe von Qualitätskontrollwerkzeugen zu entfernen. Konkret umfasst die Qualitätskontrolle hauptsächlich: Filtern basierend auf dem Phred-Qualitätswert (Q-Wert) (in der Regel werden die Basen mit Q≥20 beibehalten, und die entsprechende Fehlerquote liegt bei ≤1%), Entfernen von Reads mit einem Verhältnis von N (unbekannte Base), das 5% überschreitet, Beschneiden von Sequierungsadaptern und Primersequenzen (was durch Cutadapt und andere Werkzeuge realisiert werden kann) sowie das Entfernen von PCR-wiederholten Sequenzen (insbesondere wenn die Sequierungstiefe hoch ist, führen wiederholte Sequenzen zu Variationen).

Die Sequenzanpassung und der Standort im Referenzgenom sind die entscheidenden Schritte, um vorverarbeitete Reads an das Referenzgenom zu verankern, und ihre Genauigkeit bestimmt die Zuverlässigkeit der Mutationsdetektion. Für Arten mit Referenzgenomen (wie Reis und Arabidopsis thaliana) können kurze Sequenzanpassungswerkzeuge wie BWA und Bowtie2 verwendet werden, um eine effiziente Anpassung durch Festlegung geeigneter Parameter (wie zulässige Anzahl an Fehlanpassungen ≤2) zu erreichen. Die Vergleichsergebnisse werden normalerweise im SAM/BAM-Format gespeichert, einschließlich des Standorts der Reads im Genom, Informationen zu Fehlanpassungen usw. Für Nicht-Modellorganismen ohne Referenzgenome (wie viele Wildpflanzen) müssen wir eine de novo-Assemblierungsstrategie anwenden, um Reads mit Werkzeugen wie Stacks und UNEAK in Contigs zu clustern und anschließend die Analyse durchzuführen.

Schematische Darstellung der vier Phasen des SNP-GBS-CROP-Workflows (Melo et al., 2016)

Genotypisierung und Mutationsdetektion sind die Kernziele der GBS-Analyse, die darauf abzielt, genetische Variationen wie SNPs und InDels aus den Vergleichsdaten zu identifizieren und den Genotyp jeder Probe zu bestimmen. Diese Phase hängt von Mutationsdetektionswerkzeugen (wie GATK und TASSEL GBS) ab, und ihre Kernalgorithmen umfassen: Berechnung der Genotypwahrscheinlichkeit basierend auf dem Bayesschen Modell, Mutationsfilterung auf Bevölkerungsebene (wie minimale Allelfrequenz ≥5% und Löschrate ≤20%) sowie Erkennung abnormaler Heterozygotenverhältnisse (unter Ausschluss möglicher Probenkontamination).

Die Datenstandardisierung und Formatkonvertierung sind die Brücke zwischen der upstream-Verarbeitung und der downstream-Analyse, und die Daten sollten entsprechend den Forschungszielen in Formate umgewandelt werden, die für verschiedene Werkzeuge geeignet sind. Werkzeuge zur Analyse der Populationsgenetik (wie Structure und Admission) erfordern in der Regel die Eingabe im PLINK-Format (.ped/.map), und die VCF-Datei muss mit PLINK-Tools konvertiert werden; Werkzeuge zum Erstellen von Verknüpfungskarten (wie JoinMap) benötigen die Eingabe im Verknüpfungsformat (.loc), das mit TASSEL oder dem R/qtl-Paket konvertiert werden kann; Werkzeuge für die genomweite Assoziationsstudie (GWAS) (wie GAPIT) unterstützen das direkte Lesen von VCF-Dateien, aber niedrigqualitative Variationen (wie Stellen mit MAF<0,05) müssen vorab gefiltert werden.

Balkendiagramm, das das Ausmaß der Markerüberlappung unter den fünf bewerteten Pipelines (Melo et al., 2016) zeigt.

GBS-Datenanalysetools und deren Funktionen

Die Komplexität von GBS Datenanalyse hat eine Vielzahl von speziellen Werkzeugen hervorgebracht, die für unterschiedliche Verknüpfungen (Vergleich, Mutationsdetektion, nachgelagerte Analyse usw.) entwickelt wurden und ihre eigenen Vorteile sowie Anwendungsbereiche haben. Die Wahl der richtigen Werkzeugkombination ist der Schlüssel zur Verbesserung der Analyseeffizienz und der Zuverlässigkeit der Ergebnisse. Im Folgenden werden mehrere Kernwerkzeuge und ihre funktionalen Eigenschaften vorgestellt.

Quaste

TASSEL GBS ist eine auf Qualcomm basierende GBS-Analysepipeline, die von der Cornell University in den Vereinigten Staaten entwickelt wurde. Sie ist speziell für Pflanzenpopulationen konzipiert und unterstützt die automatische Analyse des gesamten Prozesses von Rohdaten bis zur Genotypbestimmung. Zu den Kernfunktionen gehören: Tag-Identifikation basierend auf Informationen zu Restriktionsstellen, Tag-Clustering und -Vergleich, SNP-Bestimmung und Ableitung von Genotypdaten. Der einzigartige Vorteil von TASSEL GBS liegt in seiner hohen Effizienz bei der Verarbeitung großflächiger Proben (wie zehntausenden von Pflanzenmaterialien), und die Berechnungszeit kann durch die Optimierung der parallelen Berechnung um mehr als 50 % verkürzt werden.

Schematische Darstellung der TASSEL -GBS Entdeckungs-Pipeline (Glaubitz et al., 2014)

Stapel

Stacks ist ein Werkzeug für die de novo Assemblierung und Genotypisierung von Nicht-Modellorganismen, das die Mutationsdetektion ohne Bezug zum Genom ermöglicht und häufig in der Forschung zu Wildpflanzen, Fischen und anderen Arten ohne genomische Informationen eingesetzt wird. Der Kernalgorithmus gruppiert ähnliche Reads in einem "Stack", erstellt ein vereinfachtes Genom-Tag und identifiziert dann SNPs durch die Analyse von Populationspolymorphismen. Der Vorteil von Stacks liegt darin, dass es eine hohe Toleranz gegenüber Daten mit niedriger Abdeckung hat (die minimale Sequierungstiefe kann 3× erreichen) und die direkte Berechnung von populationsgenetischen Parametern (wie Fst und π) unterstützt.

GATK

GATK (Genome Analysis Toolkit) ist ein universelles Mutationsentdeckungswerkzeug, das vom Broad Institute entwickelt wurde und hauptsächlich für die SNP-Identifizierung und Mutationsfilterung mit hoher Genauigkeit in der GBS-Datenanalyse verwendet wird. Seine Kernmodule (wie HaplotypeCaller und VariantFiltration) basieren auf einem maschinellen Lernmodell, das echte Variationen effektiv von Sequenzierungsfehlern unterscheiden kann, insbesondere für GBS-Daten von Modellorganismen wie Menschen und Mäusen. Der Vorteil von GATK liegt in seiner hohen Nachweisempfindlichkeit für komplexe Mutationen (wie multi-allele SNPs und InDels) und seiner Unterstützung für die funktionale Annotation von Mutationen (wie die Integration von Genannotationsinformationen über ANNOVAR).

PLINK

PLINK ist ein klassisches Werkzeug zur Populationsgenetik und Assoziationsanalyse, die hauptsächlich für die nachgelagerte Verarbeitung und statistische Analyse von GBS-Daten verwendet wird. Zu seinen Funktionen gehören die Datenformatkonvertierung (wie VCF→PLINK), Qualitätskontrolle (wie das Filtern von Loci mit hoher Löschrate), Analyse der Populationsstruktur (wie PCA und LD-Berechnung) und Assoziationsanalyse (wie Chi-Quadrat-Test und logistische Regression). Der Vorteil von PLINK liegt in seiner schnellen Betriebsgeschwindigkeit, die die Verarbeitung von Daten mit Millionen von SNPs und Zehntausenden von Proben ermöglicht, und sein Ausgabeformat ist mit den meisten nachgelagerten Tools (wie Structure und GCTA) kompatibel.

Die Stacks-Pipeline (Catchen et al., 2013)

Herausforderungen und Lösungen in der GBS-Datenanalyse

Obwohl die GBS-Datenanalyse einen standardisierten Prozess gebildet hat, sieht sie sich in der praktischen Anwendung weiterhin vielen Herausforderungen gegenüber, die hauptsächlich aus technischen Eigenschaften, Artenunterschieden und Datenskalierung resultieren. Angesichts dieser Probleme haben Forscher eine Reihe von Lösungen entwickelt, die eine starke Unterstützung zur Verbesserung der Analysequalität bieten.

Unebene Sequierungstiefen und fehlende Daten sind die häufigsten Herausforderungen bei der GBS-Analyse. Da GBS von der Verteilung der Restriktionsstellen abhängt, ist die Sequierungstiefe in verschiedenen Regionen des Genoms signifikant unterschiedlich (in der Regel zwischen 1× und 50×). Regionen mit geringer Tiefe sind anfällig für Genotypanruf-Fehler, während eine hohe Löschrate (> 30%) die Datenverwertungsrate verringert. Zum Beispiel wurden in Weizen-GBS-Daten etwa 20%-30% der SNP-Loci aufgrund der hohen Löschrate eliminiert, was die statistische Effektivität der nachfolgenden Analyse beeinträchtigte. Die Lösungen umfassen hauptsächlich:

• Optimierung der Sequenzierungsstrategie, Verbesserung der Abdeckungsuniformität durch Erhöhung der Sequenzierungstiefe (empfohlene durchschnittliche Tiefe ≥10×) oder Einführung eines Doppel-Enzymverdau-Schemas.
• Fehlende Werte werden basierend auf Informationen über die Kopplungsungleichgewicht (LD) durch BEAGLE, IMPUTE und andere Werkzeuge aufgefüllt. BEAGLE erzielt gute Ergebnisse in Pflanzenpopulationen, wodurch die Fehlerrate von 30 % auf weniger als 5 % gesenkt werden kann, und die Genauigkeit der Auffüllung liegt bei über 90 %.
• Adoptieren Sie robuste statistische Methoden, wie die Verwendung von gemischten linearen Modellen unter Berücksichtigung fehlender Daten in GWAS (wie den EM-Algorithmus in GAPIT), um den Informationsverlust durch Dateneliminierung zu reduzieren.

Übereinstimmung vor und nach der Anwendung des GBS SNP-Filters (Cooke et al., 2016)

Die Analyse komplexer Genome ist besonders schwierig bei polyploiden und stark repetitiven Arten (wie Weizen, Kartoffel und Zuckerrohr). Homologe Chromosomen von Polyploiden neigen dazu, Mehrdeutigkeiten bei der Sequenzanpassung zu verursachen, während stark repetitive Sequenzen den Anteil an falsch-positiven Variationen erhöhen. Zum Beispiel machen die repetitiven Sequenzen im Genom des hexaploiden Weizens mehr als 80% aus, und die Fehlerquote beim Vergleich von GBS-Daten kann 15%-20% erreichen. Um dieses Problem zu lösen, umfassen die Lösungen:

• Die Verwendung von Ausrichtungswerkzeugen, die für Polyploidie optimiert sind, wie PolyCat, zur Verbesserung der Ausrichtungsgenauigkeit durch Unterscheidung homologer, chromosomspezifischer Sequenzen, kann die Fehlerrate in Weizen auf weniger als 5 % senken.
• Verwendung haplotypbasierter Analyse-Strategien, wie HapMap3, um homologe Sequenzinterferenzen zu reduzieren und die Spezifität der Mutationsdetektion durch den Aufbau von Haplotypblöcken zu verbessern.
• Verankerung von Mutationsstellen an spezifische Chromosomen durch die Kombination von physikalischen Karten oder Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsdaten (FISH), um Verwirrung homologer Regionen zu vermeiden.

Die Konsistenzprüfung zwischen Proben und technischer Wiederholung ist der Schlüssel zur Gewährleistung der Datenzuverlässigkeit, wird jedoch oft ignoriert. Probenkontamination, Barcode-Hopping oder Sequenzierungs-Batch-Effekte können zu einem Rückgang der genotypischen Konsistenz wiederholter Proben führen. Zum Beispiel liegt die Tag-Jump-Rate der Illumina-Sequenzierungsplattform bei etwa 0,5%-2%, was in der Analyse großer Probenmengen zu falsch positiven Variationen führen kann. Die Lösungen umfassen:

• Einrichten technischer Wiederholungen im experimentellen Design (es wird empfohlen, dass jede Population mehr als 5 % der Proben wiederholt), und Bewerten der Datenqualität durch Berechnung der Genotypenkonsistenz (wie z. B. der Übereinstimmungsrate) wiederholter Proben, was in der Regel eine Konsistenz von mehr als 95 % erfordert.
• Verwendung von bioinformatischen Werkzeugen zur Erkennung abnormaler Proben, wie z.B. die Identifizierung von Proben mit abnormalem genetischen Hintergrund durch Identität nach Zustand (IBS)-Analyse in PLINK oder den Ausschluss von Ausreißern durch PCA-Clustering.
• Batch-Effekt-Korrektur unter Verwendung von SVA, ComBat und anderen Werkzeugen, um den Einfluss von Sequenzierungsbatches auf die Daten zu entfernen, insbesondere bei der Integration von GBS-Daten aus verschiedenen Zeiträumen.

Erkennung von Populationsstruktur und -wachstum mit GBS-Daten (Cooke et al., 2016)

Analyse- und Visualisierungstools für GBS-Daten

Nach der Qualitätskontrolle, dem Vergleich und der Mutationsdetektion müssen GBS-Daten nachgelagert analysiert werden, um die biologische Bedeutung zu erforschen, wie z. B. die Analyse der genetischen Struktur von Populationen, die Genkartierung, den Bau von Verknüpfungskarten usw. Gleichzeitig können Visualisierungstools komplexe Daten in intuitive Diagramme umwandeln, um die Ergebnisse zu interpretieren und darzustellen. Im Folgenden werden mehrere zentrale nachgelagerte Analyse- und Visualisierungstools sowie deren Anwendungszenarien vorgestellt.

Das Werkzeug zur Analyse der genetischen Struktur von Populationen wird verwendet, um die genetischen Beziehungen zwischen Proben und die Populationsstratifizierung zu analysieren, die die Grundlage der Evolutionsforschung und der Assoziationsanalyse bildet. Structure ist ein Werkzeug zur Inferenz der Populationsstruktur, das auf einem bayesianischen Modell basiert und die potenzielle genetische Struktur der Population offenbart, indem es Proben hypothetischen k Untergruppen zuweist. In der Studie von Pflanzen-GBS wird Structure häufig verwendet, um die Ökotypen kultivierter Arten zu unterteilen.

Das genomanalytische Assoziationsstudien-Tool (GWAS) wird verwendet, um genetische Variationen in Bezug auf Phänotypen in natürlichen Populationen zu untersuchen, und es wird häufig in der Forschung zu komplexen Eigenschaften von Pflanzen eingesetzt. Gapit (genomische Assoziation und prädiktives integriertes Tool) ist ein GWAS-Tool, das auf der R-Sprache basiert, das gemischte lineare Modelle (MLM) unterstützt und effektiv die Beeinflussung von Gruppenstruktur und Verwandtschaft auf die Assoziationsergebnisse kontrollieren kann.

Datenvisualisierungstools können die Ergebnisse der GBS-Analyse in intuitive Diagramme umwandeln und helfen, die Ergebnisse zu interpretieren. Circos wird verwendet, um eine zirkuläre Chromosomenkarte zu zeichnen, die mehrdimensionale Informationen wie SNP-Dichte, Genstandorte, QTL-Intervalle usw. anzeigen kann. Zum Beispiel kann Circos im Weizengenom deutlich die Korrelation zwischen der Verteilung von krankheitsresistenten Genen auf verschiedenen Chromosomen und GBS-Markern zeigen. Ggplot2 ist ein Zeichnungspaket in der R-Sprache, das das Zeichnen von PCA-Streudiagrammen, LD-Abklingkurven, phylogenetischen Bäumen von Populationen usw. unterstützt. Seine hochgradig anpassbaren Parameter können den Anforderungen einer vielfältigen Visualisierung gerecht werden.

Multiomics-Datenintegrationswerkzeuge werden verwendet, um GBS-Genotypdaten mit phänotypischen Daten wie Transkriptom und Metabolom zu korrelieren und den molekularen Regulationsmechanismus von Merkmalen aufzudecken. WGCNA (gewichtete Gen-Co-Expressionsnetzwerkanalyse) kann GBS-Marker mit Genexpressionsdaten verknüpfen und Co-Expressionsmodule identifizieren, die mit Zielmerkmalen in Zusammenhang stehen.

Überblick über das R/Bioconductor-Paket SWATH2stats (Blattmann et al., 2016)

Fazit

Die rasante Entwicklung der GBS-Technologie fördert die Innovation in der Pflanzengenetik und der Züchtungsforschung. Die Datenanalyse, als zentrale Verbindung zwischen Technologie und wissenschaftlicher Entdeckung, bestimmt direkt die Nutzungseffizienz der GBS-Daten durch den Fortschritt ihrer Methoden und Werkzeuge. Dieser Artikel fasst den grundlegenden Prozess, die Kernwerkzeuge, Herausforderungen und Anwendungen der GBS-Datenanalyse zusammen und bietet eine systematische Referenz für Forscher.

Referenzen:

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