Transkriptomforschung: Einzelzell- und räumliche Transkriptomik

Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) und räumliche Transkriptomik sind fortgeschrittene Techniken, die einzigartige Vorteile bei der Aufklärung der zellulären Heterogenität und der Gewebearchitektur bieten. Diese Methoden haben in verschiedenen Forschungsbereichen erhebliche Aufmerksamkeit erregt.

Einzelzell-RNA-Sequenzierung

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) stellt einen neuartigen Ansatz für die Hochdurchsatzsequenzierung von mRNA auf Einzelzellebene dar. Diese Technik beinhaltet die effiziente Amplifikation minimaler Mengen von mRNA, die aus isolierten Einzelzellen extrahiert werden, gefolgt von einer Hochdurchsatzsequenzierung. Die Anwendungen der Einzelzellsequenzierung erstrecken sich über mehrere Bereiche, einschließlich Entwicklungsbiologie, Onkologie, Neurowissenschaften, Immunologie, der Untersuchung von Krankheitsmechanismen und dem Aufbau von zellulären Atlanten.

Begründung für die Einzelzell-Transkriptomanalyse

Zellen arbeiten nicht isoliert; vielmehr kooperieren sie, um biologische Funktionen zu erfüllen. Wie das Sprichwort sagt: "Keine zwei Blätter sind genau gleich," besitzt jede Zelle einzigartige Eigenschaften und erfüllt unterschiedliche Rollen in ihrer Umgebung.

Traditionelle transkriptomische Methoden, wie zum Beispiel Bulk-RNA-Sequenzierung (Bulk-RNA-Seq) erfordert das Mahlen und die Extraktion von gemischtem Gesamt-RNA aus Organismen, Geweben oder Zellpopulationen für die Sequenzierung. Folglich repräsentieren die resultierenden Daten durchschnittliche transkriptomische Profile aus verschiedenen zellulären Bestandteilen. Dieser Ansatz neigt dazu, interzelluläre Unterschiede zu übersehen und die zelluläre Heterogenität zu verschleiern. Tatsächlich beschreibt Bulk-RNA-Seq oft einen hypothetischen Zustand, der den tatsächlichen Status einzelner Zellen möglicherweise nicht genau widerspiegelt.

Im Gegensatz dazu kann die scRNA-seq-Technologie die Heterogenität und Komplexität von RNA-Transkripten innerhalb einzelner Zellen aufdecken sowie die Zusammensetzung verschiedener Zelltypen und Funktionen in hochorganisierten Geweben, Organen und Organismen abgrenzen. Dieser technologische Fortschritt hat das Feld der Transkriptomik.

Abbildung 1: Vergleich von scRNA-seq und Bulk RNA-seq

Technische Vorteile

Offenlegung der zellulären Heterogenität und hochauflösende AnalyseDiese Technik erleichtert die Identifizierung von zellulären Subpopulationen und seltenen Zelltypen und bietet umfassende Einblicke in zelluläre Funktionen und Zustände.

Untersuchung dynamischer ProzessescRNA-seq eignet sich zur Untersuchung der Evolution der Genexpression während dynamischer Prozesse wie Zell-Differenzierung, Proliferation und Tumorigenese.

Unvoreingenommene ZellclusterungDie Methode ermöglicht eine genauere Klassifizierung von Zellen, insbesondere in den Bereichen Immunologie, Onkologie und Genetik.

Implementierung der Einzelzell-Transkriptomik

Die primäre Unterscheidung zwischen dem operativen Workflow von scRNA-seq und traditionelles Bulk-RNA-Seq liegt in der Anforderung, einzelne Zellen zu isolieren. Ein typischer scRNA-seq-Prozess besteht aus den folgenden Schritten: Probenentnahme, Einzelzellisolierung, Zelllyse, reverser Transkription, cDNA-Amplifikation, Bibliothekskonstruktion, Sequenzierung und Datenanalyse. Aktuelle Mainstream-scRNA-seq-Technologieplattformen umfassen:

Mikrofluidische PlattformenBeispiele sind 10x Genomics, MobiNova und DNBelab C4, die mikrofluidische Chips und das Prinzip der Unlöslichkeit zwischen Öl und Wasser zur Isolation von Einzelzellen nutzen.

MikroplattenplattformenZum Beispiel nutzt die BD Rhapsody-Plattform die Schwerkraft, um die Ablagerung von Zellen in Mikrowellchen zur Trennung zu erleichtern.

Räumliche Transkriptomik

Räumliche Transkriptomik ermöglicht die Erfassung der gesamten Transkriptom-Expression innerhalb von Zellen, während deren räumliche Lage im Gewebe erhalten bleibt. Dieser Ansatz erlaubt eine tiefere Untersuchung der räumlichen Heterogenität. Zu den Anwendungen gehören die Identifizierung seltener Zelltypen, Studien zu Wachstum und Entwicklung, die Erforschung von Krankheitsmechanismen und die Analyse des Tumormikroumfelds.

Bei der Einzelzellsequenzierung können während der Gewebedissociation und der mikrofluidischen Verarbeitung Zellproben verloren gehen, was möglicherweise zu Verzerrungen der Informationen führt. Darüber hinaus führt die Einzelzellsequenzierung häufig zum Verlust von räumlichen Positionsdaten der Zellen. Die räumliche Transkriptomik behebt den Mangel an räumlichen Informationen, der der Einzelzelltranskriptomik innewohnt.

Technische Vorteile

Beibehaltung räumlicher InformationenDiese Methodik bewahrt die räumlichen Positionen von mRNA innerhalb von Gewebeschnitten, wodurch interzelluläre Interaktionen und die organisatorische Struktur sichtbar werden. Sie ist besonders anwendbar auf Studien, die morphologisch unterschiedliche Gewebe wie das Gehirn, Embryonen und Riechkolben betreffen.

Umfassende transkriptomische AnalyseEs bietet einen umfassenden Überblick über die mRNA-Expression auf zellulärer Ebene und verbessert das Verständnis der zellulären Aktivität in komplexen Geweben. In der Onkologieforschung kann diese Technik Genexpressionsgradienten und Heterogenität innerhalb von Tumorregionen aufdecken.

Implementierung der räumlichen Transkriptomik

Derzeit gibt es verschiedene Methoden zur Implementierung der räumlichen Transkriptomik, einschließlich bildgebender Verfahren, die auf in situ Hybridisierung basieren, und solchen, die auf transkriptomischer Sequenzierung beruhen. Unter diesen ist die Hochdurchsatz-Transkriptom-Sequenzierungsplattform, 10x Visiumist eine der etablierten kommerziellen Technologien.

Die 10x Visium-Plattform nutzt Mikroarray-Technologie, um geordnete Oligonukleotid-Arrays auf Glasplatten abzulegen. Anschließend werden dünne Gewebeschnitte über das Array gelegt, und die Permeabilisierung ermöglicht die Diffusion von zellulärem RNA zu Oligonukleotiden mit Barcodes. Die in situ Reverse-Transkription erzeugt cDNA mit räumlichen Indizes, die dann einer Hochdurchsatz-Sequenzierung unterzogen wird.

Abbildung 2: Prinzipien der 10x Visium Spatial Transcriptomics Sequenzierung

Integrierte Analyse von Einzelzell- und räumlichen Transkriptomdaten

In den letzten Jahren, aufkommend räumliche Transkriptomik-Technologien haben die Rekonstruktion der Gewebearchitektur und der räumlichen Positionierung von Zellen ermöglicht. Allerdings bleibt die Auflösung dieser Technologien oft hinter der Erreichung einer Einzelzellgenauigkeit zurück. Daher kann die Integration von räumlicher Transkriptomik mit Einzelzelltranskriptomik hochauflösende räumliche Einzelzellkarten erstellen, was einen synergistischen Effekt erzeugt, der die individuellen Anwendungen jeder Technik übersteigt. Die folgenden Abschnitte werden die konzeptionellen Rahmenbedingungen für die Assoziationsanalyse dieser beiden Methoden untersuchen, ergänzt durch Fallstudien, um ihre Anwendung zu veranschaulichen.

Analysemethoden und -prinzipien

Zwei primäre analytische Ansätze zur Integration von Einzelzell-Transkriptomdaten mit räumlichen Transkriptomdaten sind Dekonvolution und Mapping. Grundsätzlich beinhalten diese Methoden die Integration von Einzelzellkarten, wie sie durch Einzelzell-Transkriptomik bereitgestellt werden, mit räumlichen Karten, die aus der räumlichen Transkriptomik abgeleitet sind, wodurch ein räumlicher Einzelzell-Atlas erstellt wird. Die folgenden Abschnitte werden die analytischen Strategien und Methoden hervorheben, die in diesem Integrationsprozess verwendet werden.

Abbildung 3: Strategische Ansätze zur integrativen Analyse von Einzelzell- und räumlicher Transkriptomik

Dekonvolution

Die Dekonvolution bezieht sich auf den Prozess, gemischte transkriptomische Signale, die aus räumlich aufgelösten Proben gewonnen wurden, in ihre Bestandteile Zelltypen zu trennen. Durch die Nutzung der Einzelzell-transkriptomischen Profile ermöglicht diese Methode die Schätzung der Häufigkeit verschiedener Zelltypen innerhalb spezifischer räumlicher Regionen einer Gewebeprobe.

Kartierung

Mapping umfasst die Ausrichtung von Einzelzell-Transkriptomdaten auf das räumliche Transkriptom-Framework. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Einzelzell-Expressionsprofilen im Kontext der Gewebearchitektur und erleichtert ein tieferes Verständnis von zellulären Interaktionen und funktionalen Zuständen in situ.

Die Integration dieser Methoden stellt eine leistungsstarke Strategie dar, um die Komplexität der Gewebeorganisation und des Zellverhaltens zu erhellen. Durch die sorgfältige Anwendung von Dekonvolutions- und Kartierungstechniken können Forscher wertvolle Einblicke in die zelluläre Zusammensetzung und die funktionalen Dynamiken verschiedener biologischer Systeme gewinnen.

Zelluläre Genmerkmale

Der Bau von räumlichen Einzelzellkarten ermöglicht die Untersuchung der Verteilungsmuster von Zielzellunterpopulationen sowie der räumlichen und unterpopulation-spezifischen Verteilung von Zielgenen. Anschließend können differenzielle Genanalysen und Anreicherungsanalysen durchgeführt werden, um Gene mit der höchsten Hochregulation als charakteristische Gene der Unterpopulation zu identifizieren und somit ihre Verteilung über räumliche und verschiedene Zellunterpopulationen zu erhellen.

Lokalisierung und Korrelation

Weitere Analysen können die Ko-Lokalisierung von Genen und Zellen untersuchen, wodurch Rezeptor-Ligand-Interaktionen und transkriptionale regulatorische Beziehungen sowie interzelluläre Interaktionen sichtbar werden. Darüber hinaus können räumliche Regionen, Zellen und Gene mit Gewebephänotypdaten korreliert werden, was die Untersuchung der Beziehung zwischen räumlichen Merkmalsverteilungen und phänotypischen Funktionen ermöglicht.

Entwicklungstrajektorien

Anschließend kann eine räumliche Pseudo-Zeit-Analyse eingesetzt werden, um die räumlichen Pseudo-Zeit-Differenzierungstrajektorien von Zellen zu konstruieren. Durch die Kombination der differentiellen Genanalyse können räumlich relevante Entwicklungsmerkmale und differenzierungsfördernde Gene von Subpopulationen identifiziert werden, wodurch die regulatorischen Mechanismen der zellulären Entwicklungsdifferenzierung beleuchtet werden. Darüber hinaus kann die RNA-Geschwindigkeitsanalyse dabei helfen, die gerichteten Dynamiken der Zell-Differenzierung abzuleiten und somit die Ergebnisse der Pseudo-Zeit-Analysen zu validieren.

Zellkommunikation

Darüber hinaus können Erkenntnisse über die Interaktionsbeziehungen zwischen Zellunterpopulationen aus räumlichen Positionsdaten und Rezeptor-Ligand-Interaktionen abgeleitet werden. Nach der Identifizierung wichtiger interagierender Zellpaare können weitere Untersuchungen zu ihren Rezeptorgenpaaren und molekularen Regulationsmechanismen angestellt werden, sowie Analysen der Unterschiede zwischen den Gruppen, um die Auswirkungen experimenteller Behandlungen auf die Zellkommunikation zu bewerten.

Genregulation

Schließlich kann die Integration der Analyse von Transkriptionsfaktoren und der Netzwerk-Analyse den Aufbau von transkriptionalen Regulierungsnetzwerken erleichtern. Dieser Ansatz ermöglicht die Identifizierung von Schlüsselgenen und Transkriptionsfaktoren sowie die Untersuchung ihrer räumlichen Koexpression, wodurch die Regulationsmechanismen kritischer Signalwege und deren Assoziationen mit Phänotypen offengelegt werden.

Anwendungsfälle

Die nachfolgenden Abschnitte werden veranschaulichen, wie die oben genannten Forschungsstrategien anhand von zwei spezifischen Fallstudien angewendet werden.

Fallstudie 1

In einem Artikel aus dem Jahr 2023, der veröffentlicht wurde in Zelle (Impact Factor = 45,5) führten die Autoren Einzelzell-Transkriptomik und räumliche Transkriptomik in verschiedenen Gehirnregionen von Menschen in der 6. bis 23. Schwangerschaftswoche (GW) durch. Diese Studie erstellte einen spatiotemporalen Atlas des menschlichen Gehirns, der die räumlichen Verteilungsmuster verschiedener Zelltypen aufdeckte (siehe Abbildung 2AB). Die Autoren untersuchten weiter die Heterogenität menschlicher neuraler Vorläuferzellen (NPCs) und klassifizierten sie in fünf Subpopulationen. Unter diesen trat die radiale Gliazelle (RG) als die früheste Population hervor und zeigte eine signifikante regionale Heterogenität. Darüber hinaus wurde der Transkriptionsfaktor TFAP2C spezifisch in RG-Zellen exprimiert und stellte sich als entscheidend für deren Schicksal heraus. Diese Studie nutzte effektiv die erste Forschungsstrategie, um die räumlichen Verteilungseigenschaften von Zellsubpopulationen im menschlichen Gehirn zu untersuchen.

Abbildung 4: Spatiotemporales Transkriptomisches Atlas der menschlichen Gehirnentwicklung

Anschließend verwendeten die Autoren eine Pseudo-Zeit-Analyse, um die Entwicklungsverläufe spezifischer neuronaler Subpopulationen aus fünf verschiedenen Hirnregionen zu rekonstruieren. Es wurde beobachtet, dass kortikale radiale Gliazellen (vRG und oRG) sich in gehirnspezifische intermediäre Vorläuferzellen (IPC) und Vorläuferzellen (Prec2) differenzieren, die letztendlich zu kortikalen glutamatergischen Neuronen (Glu1 und Glu4) heranreifen. Darüber hinaus entwickelt sich das Sp-RG in der ganglionären Eminenz (GE) in Richtung GABAergischer Neuronen im Kortex.

Zusätzlich neigen die radialen Gliazellen im Zwischenhirn (Dien RG-1) dazu, sich in LHX6+ GABAerge Neuronen zu differenzieren, während Dien RG-2 auf die Entwicklung von glutamatergischen Neuronen ausgerichtet ist. Die Ergebnisse der räumlichen Visualisierung zeigen, dass Dien RG-1 und LHX6+ GABAerge Neuronen hauptsächlich im ventralen Bereich des Zwischenhirns lokalisiert sind, während Dien RG-2 und glutamatergische Neuronen des Zwischenhirns überwiegend im dorsalen Bereich angesiedelt sind. Diese räumliche Verteilung bestätigt weiter die Ergebnisse, die aus der Analyse von Einzelzell-Daten abgeleitet wurden.

Zusammenfassend wurde die dritte Forschungsstrategie genutzt, um die Entwicklung spezifischer neuronaler Subtypen in verschiedenen Gehirnregionen durch räumliche Pseudo-Zeit-Analyse zu untersuchen.

Abbildung 5: Analyse der Pseudo-Zeitlichen räumlichen Verteilung von Zielzellunterpopulationen

Schließlich führten die Autoren eine Analyse der Zellkommunikation durch, um die Interaktionen zwischen Gliazellen und GABAergen Neuronen zu untersuchen. Es wurde beobachtet, dass die ligandassoziierten Gene NCAM1 und NRXN1 hohe Expressionsniveaus in frühen oligodendrozytären Vorläuferzellen (OPC-1) und GABA-7 aufwiesen, während die rezeptorassoziierten Gene L1CAM und NLGN1 in GABA-7 bzw. frühen OPC-1 angereichert waren (siehe Abbildung 4A). Diese Interaktionen wurden überwiegend im ventralen Zwischenhirn (VD) identifiziert.

Zusätzlich zeigte die Analyse Wechselwirkungen zwischen Gliazellen und Neuronen aus anderen Regionen. Frühe OPC-2 wurden an der Grenze zwischen der Rinde (Cor) und dem Subpallium (Sp) lokalisiert, während glutamatergische Neuronen Glu1 und Glu4 den Liganden NRG1 sekretieren, der OPCs anzieht, um in Richtung der Rinde zu migrieren.

Zusammenfassend wurde die vierte Forschungsstrategie eingesetzt, um die Wechselwirkungen zwischen Gliazellen und Neuronen zu erläutern sowie die räumlichen Verteilungsvorlieben der Gliazellen während des Entwicklungsprozesses zu charakterisieren.

Abbildung 6: Räumliche Verteilung und Interaktionen von Gliazellen

Fallstudie Zwei

In einer Studie, die veröffentlicht wurde in Zellentdeckung (Impact Factor = 33,5) Im Jahr 2024 führten die Autoren eine räumliche Einzelzell-Multi-Omik-Analyse des menschlichen Kleinhirns durch. Die Untersuchung identifizierte GABAerge Linien, wie Interneuronen und Purkinje-Zellen (PKCs), sowie exzitatorische Linien, einschließlich unipolarer Bürstenzellen (UBCs), Granulazell (GC)-Progenitoren und postmitotischer GCs.

Die Analyse ergab, dass die Häufigkeit der PKCs in der 13. Schwangerschaftswoche (GW13) ihren Höhepunkt erreichte und anschließend einen starken Rückgang zeigte. Räumliche transkriptomische Daten wiesen auf eine mehrschichtige, zirkumferentielle Verteilung verschiedener Zelltypen in GW13 hin, die mit der äußeren externen Körnerzellschicht (oEGL), der inneren externen Körnerzellschicht (iEGL), der intermediären Zone (IZ) und der ventrikulären Zone (VZ) korrespondierte. In der 16. Schwangerschaftswoche (GW16) wurden ebenfalls bemerkenswerte Trennungen des rhombischen Lippen (RL), der externen Körnerzellschicht (EGL) und der Purkinje-Zellschicht (PCL) festgestellt.

Zusammenfassend nutzte diese Studie die erste Forschungsstrategie, um die räumlichen Verteilungseigenschaften von Subpopulationen von Kleinhirnzellen zu untersuchen.

Abbildung 7: Temporale und räumliche transkriptomische Karte der menschlichen Kleinhirnentwicklung

In der nachfolgenden Analyse verwendeten die Autoren die Pseudo-Zeit-Analyse, um die Entwicklungstrajektorie der Granulazelllinien (GC) zu rekonstruieren. Die Granulazellvorläufer (GCPs) wurden in zwei verschiedene Populationen unterteilt: ATOH1+ GCPs (AT+GCPs) und NEUROD1+ GCPs (ND+GCPs). In der 13. Schwangerschaftswoche (GW13) wurde beobachtet, dass sich die ND+GCPs unter den AT+GCPs positionierten und eine deutliche innere-äußere Trennung in ihrer Verteilung aufwiesen.

Weitere Analysen umfassten die Auswahl von Transkriptionsfaktoren, die in Vorläufer- oder post-mitotischen Zellen angereichert waren, für die Analyse von Genregulationsnetzwerken (GRN). Dieser Ansatz zielte darauf ab, Schlüsselgene zu identifizieren, die möglicherweise Zellzustandsübergänge während der GC-Differenzierung regulieren. Es wurde festgestellt, dass neben ATOH1 auch Transkriptionsfaktoren wie YBX3 und MEF2C eine Rolle in der GC-Entwicklung spielen könnten.

Zusammenfassend nutzte diese Studie die dritte und fünfte Forschungsstrategie, um die Differenzierung und regulatorischen Mechanismen der GC-Linie zu untersuchen.

Abbildung 8: Räumliche Verteilung der Granulazell-Linien und des Differenzierungsregulierungsnetzwerks

Zusammenfassung

Zusammenfassend ermöglicht die kombinierte Anwendung von Einzelzell- und räumlicher Transkriptomik die Integration räumlicher Informationen mit Einzelzellauflösung. Dieser Ansatz ermöglicht eine umfassende Untersuchung der Verteilungseigenschaften von Zellunterpopulationen, der Entwicklungsdifferenzierung, der Interaktionen und der Regulationsmechanismen aus mehreren Dimensionen.

Referenzen:

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2. Li Y, Li Z, Wang C, et al. Spatiotemporales Transkriptom-Atlas zeigt die regionale Spezifikation des sich entwickelnden menschlichen Gehirns. Zelle, 2023, 186(26): 5892-5909. e22.
3. Yang F, Zhao Z, Zhang D, et al. Einzelzell-Multi-Omik-Analyse der Linienentwicklung und räumlichen Organisation im menschlichen fetalen Kleinhirn. Zellentdeckung, 2024, 10(1): 22.