Einzelzell-RNA-Sequenzierung von Mikroorganismen

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) war entscheidend für das Entschlüsseln wichtiger Erkenntnisse in Säugetiersystemen und hat unser Verständnis der transkriptionalen Vielfalt über Zelltypen und -zustände hinweg bereichert. Ebenso wichtig ist die Notwendigkeit, die Expressionsheterogenität auf Einzelzellebene in Bakterien und Mikrobiomen aufzudecken.

Während scRNA-seq bedeutende Fortschritte bei der Aufklärung der Komplexität eukaryotischer Zellen, einschließlich Pflanzen und Tieren, gemacht hat und zu einem Grundpfeiler der biologischen Forschung geworden ist, sieht sich die mikrobielle scRNA-seq-Technologie erheblichen Herausforderungen gegenüber. Zu diesen Hindernissen gehören:

• Niedrige mRNA-Abundanz: Der mRNA-Gehalt von Bakterien ist auffallend gering, etwa zwei Größenordnungen niedriger als der in Säugetieren.
• PolyA-Abwesenheit: Im Gegensatz zu eukaryotischen Gegenstücken fehlt bakterieller mRNA die PolyA-Struktur an ihrem 3'-Ende, was ihre Erfassung und Analyse zu einer komplexen Aufgabe macht.
• Kurze mRNA-Halbwertszeit: Bakterielle mRNA hat eine erheblich kürzere Halbwertszeit im Vergleich zu Säugetier-mRNA, was eine schnelle und effiziente Verarbeitung erforderlich macht.
• Zellwanddicke: Bakterienzellen verfügen über dickere Zellwände, die vollständige Lyse und die effiziente Freisetzung von mRNA zur Analyse erschweren.
• Herausforderungen der mikrobiellen Größe: Die winzige Größe mikrobieller Zellen erschwert die Isolation einzelner Zellen zur Analyse.

In den letzten Jahren haben engagierte Wissenschaftler technische Innovationen vorangetrieben, was zur Entwicklung verschiedener Methoden zur Einzelzell-RNA-Sequenzierung von Bakterien geführt hat, einschließlich microSPLIT und BacDrop.

Einzelzell-Sequenzierungs- und Analyse-Workflow für standardisierte (untargeted) und gezielte Einzelzell-Sequenzierungsansätze. (Woyke et al., 2017)

Eukaryotische Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq)

In der zeitgenössischen Forschung hat sich die eukaryotische scRNA-seq zu einer weit verbreiteten Technik entwickelt, die eine Vielzahl von Experimenten, analytischen Ansätzen und mehreren kommerziell verfügbaren Plattformen umfasst.

Durch die Nutzung eines Makrophagen-Infektionsmodells hat die scRNA-seq die schnelle Polarisation von Salmonellen-infizierten Wirtszellen aufgedeckt, eine Beobachtung, die den Mixed-Pool-RNA-seq-Techniken entgangen war. Diese Analyse zeigte zudem, dass aktiv replizierende Salmonellen überwiegend in anti-inflammatorischen, anfälligen M2-Makrophagen vorkommen, während nicht replizierende Bakterien hauptsächlich in pro-inflammatorischen M1-Makrophagen lokalisiert sind. Bemerkenswerterweise korreliert die Rate der bakteriellen Replikation mit dem Ausmaß der Wirtsinterferonantwort. Die Integration von scRNA-seq-Daten mit entsprechenden Dual-RNA-Seq Daten haben eine Verbindung zwischen der Expression eines spezifischen Virulenzfaktors von Salmonella und der Polarisation von Makrophagen hergestellt. Salmonella manipuliert aktiv Wirtszellen, um ein günstiges Umfeld für die Replikation zu schaffen, was die Virulenzstrategie von Mycobacterium tuberculosisDiese Einzelzell-Datensätze stellen eine wertvolle Ressource dar, um die Heterogenität verschiedener Wirtszelltypen zu erforschen.

Eine Einschränkung der herkömmlichen scRNA-seq ist ihre Abhängigkeit von Poly(A) zur Erfassung von Transkripten, was zu einem Verlust von Informationen über Transkripte ohne Poly(A)-Schwänze, wie nicht-kodierende Transkripte, führt. Um diese Herausforderung zu bewältigen, haben Forscher eine Methode namens Small-seq entwickelt, die auf 3'-Ende-Verknüpfungen basiert und die Detektion von miRNAs, tRNAs und snoRNAs in einzelnen Säugetierzellen ermöglicht. Eine weitere Methode, Holo-seq, untersucht sowohl sRNAs als auch mRNAs innerhalb einer einzelnen Zelle. Während der aktuelle Stand der Infektionsbiologie eher auf mRNA-fokussierte Untersuchungen ausgerichtet ist, richten Forscher zunehmend ihre Aufmerksamkeit auf die Wechselwirkungen zwischen nicht-kodierenden Transkripten und ihren Wirten. Zum Beispiel zeigen in mit Salmonella infizierten menschlichen Zellen die lncRNA-Profile schnellere Veränderungen als mRNAs, wobei bestimmte Wirts-lncRNAs die Fähigkeit zeigen, die Anfälligkeit für eine Salmonella-Infektion zu verringern. Darüber hinaus dienen einige hochkonservierte bakterielle sRNAs als kritische Regulatoren, während bestimmte miRNAs zur Abwehr von Pathogenen beitragen und andere aktiv von Salmonella ausgenutzt werden, um die Pathogenese zu erleichtern. Das Studium nicht-kodierender Transkripte in Wirts-Mikroben-Interaktionen birgt vielversprechendes Potenzial für die weitere Entwicklung in der Zukunft.

Bakterielle Einzelzell-RNA-Sequenzierung

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) bei Bakterien hat erhebliche technische Herausforderungen bewältigen müssen, die ihre weit verbreitete Anwendung in Prokaryoten behindert haben. Zu diesen Hürden gehören Faktoren wie die kleine Zellgröße, die komplexe Zelltrennung, das Vorhandensein von starren Zellwänden und das Fehlen von PolyA-Schwänzen an mRNA-Molekülen. Infolgedessen befindet sich die Anwendung von scRNA-seq in der bakteriellen Forschung noch in den Kinderschuhen.

Mehrere neuartige Technologien zur Erkennung von bakteriellen Transkripten wurden entwickelt, um diese Herausforderungen zu bewältigen. Zu den bemerkenswerten Methoden gehören MATQ-seq, MicroSPLiT, PETRI-seq, scDual-seq und die PatH-Cap-Technologie. Besonders scDual-seq und PatH-Cap wurden speziell für die Erkennung intrazellulärer Bakterien entwickelt. Wissenschaftler haben beispielsweise MATQ-seq eingesetzt, um zu analysieren Salmonella typhimurium und Pseudomonas aeruginosa Nach der Isolierung der Zellen ergab die vergleichende Analyse mit traditionellen Mixed-Pool-RNA-Seq-Daten, dass MATQ-Seq darin hervorragend abschneidet, die Expressionsmuster wachstumsabhängiger Gene genau zu erfassen.

Verbessertes MATQ-seq-Workflow für bakterielle Einzelzell-RNA-seq. (Homberger et al., 2023)

In einer anderen Studie wurde PETRI-seq eingesetzt, um E. coli und Staphylococcus aureus zu untersuchen, wobei etwa 200-300 mRNAs pro Bakterium erfasst wurden. In der Zwischenzeit wurde microSPLiT auf einzelne Bacillus subtilis und E. coli Zellen, die im Durchschnitt über 300 mRNA-Kopien pro Bakterium nachweisen. Obwohl diese Methoden eine Sequenzierung des Transkriptoms einzelner Bakterien ermöglichten, hinken sie ihren eukaryotischen Pendants in Bezug auf den zellulären Durchsatz, die mRNA-/Gen-Erfassungsraten und die Sequenzierungstiefe der Gene weiterhin hinterher.

Das Gebiet der mikrobiellen Einzelzell-RNA-Sequenzierung entwickelt sich schnell weiter, wobei Technologien zur Einzelbakterien-RNA-Sequenzierung für sowohl gramnegative als auch grampositive Arten weiterhin entstehen. Während die Machbarkeitsstudie kurz vor dem Abschluss steht, besteht die nächste Herausforderung darin, natürliche mikrobielle Gemeinschaften zu untersuchen, in denen einzelne Bakterien möglicherweise nur eine begrenzte Anzahl von mRNAs besitzen, die oft ein paar Hundert nicht überschreiten. Um in diesem Bereich Fortschritte zu erzielen, ist es entscheidend, effiziente Lyse- und rRNA-Entfernungstechniken für einzelne Bakterien unter Verwendung von CRISPR-basierten Protokollen zu entwickeln. Darüber hinaus ist die Entwicklung von mikrofluidikbasierten Geräten zur Vereinfachung der Probenhandhabung von entscheidender Bedeutung.

Mikrobielle Gemeinschaften können eine definierte räumliche Organisation mit spezifischen Funktionen sowohl in gesunden als auch in kranken Zuständen aufweisen, was die Integration von scRNA-seq mit fortschrittlichen Bildgebungstechniken erforderlich macht, um diese Beziehungen zu entschlüsseln. Schließlich wird das Entwirren der Rollen von mikrobiellen Untergruppen im Laufe der Zeit und in verschiedenen räumlichen Kontexten entscheidend sein, um gezielte therapeutische Interventionen zu entwerfen.

Referenzen:

1. Homberger, Christina, et al. "Verbesserte bakterielle Einzelzell-RNA-Sequenzierung durch automatisierte MATQ-Sequenzierung und Cas9-basierte Entfernung von rRNA-Reads." Mbio 14.2 (2023): e03557-22.
2. Woyke, Tanja, Devin FR Doud und Frederik Schulz. "Die Entwicklung der mikrobiellen Einzelzell-Sequenzierung." Naturmethoden 14.11 (2017): 1045-1054.