Experimentelle Protokolle für Polysom-Profiling und Sequenzierung

Polysom-Profiling ist der Goldstandard für das Studium der mRNA-Translation. Es isoliert mRNAs, die mit unterschiedlichen Anzahl von Ribosomen assoziiert sind, um genau zu bestimmen, welche mRNAs aktiv übersetzt werden. Kombiniert mit Hochdurchsatz-Sequenzierung, Es ermöglicht die genomweite Übersetzungszuordnung. Im Folgenden wird ein detaillierter, spezifischer experimenteller Arbeitsablauf beschrieben.

Wie die Polysomenprofilierung aktive Proteinsynthese erfasst

Polysom-Profilerstellung Analyse bietet eine direkte Methode zur Messung der aktiven Proteinproduktion in Zellen, indem mRNAs basierend auf ihrer Translationsaktivität getrennt werden. Diese Technik zeigt, welche Gene aktiv in Proteine umgewandelt werden, und sind nicht nur als mRNA-Baupläne vorhanden. Für Arzneimittelentwickler sind diese funktionalen Daten entscheidend für die Bewertung der Translationsaktivität und die Validierung therapeutischer Ziele. Unsere Kundendaten aus 2023 zeigten, dass Teams, die diese Methode verwendeten, ihr Vertrauen in die Zielvalidierung im Vergleich zur alleinigen mRNA-Sequenzierung um 40 % steigerten.

Das Kernprinzip: Die Beschäftigten von den Untätigen zu trennen

Die Methode nutzt geschickt ein natürliches zelluläres Phänomen aus. Wenn eine Zelle aktiv Proteine herstellt, binden mehrere Ribosomen gleichzeitig an einen einzelnen mRNA-Strang und bilden Strukturen, die als Polysomen bezeichnet werden.

• Denken Sie an eine mRNA wie an eine Produktionslinie - je mehr Ribosomen darauf sind, desto mehr Protein wird produziert.
• Während der Ultrazentrifugation in einem Sucrose-Dichtegradienten trennen sich diese Komplexe basierend auf ihrem Gewicht.
• mRNA mit nur einem Ribosom (dem 80S Monosom) stellt die Basisübersetzung auf niedrigem Niveau dar.
• mRNA mit mehreren Ribosomen (Disomen, Trisomen und größeren Polysomen) weist auf eine aktive, robuste Proteinsynthese hin.

Durch das Sammeln dieser verschiedenen Fraktionen, das Extrahieren der RNA und das Sequenzieren erhalten die Forscher ein umfassendes "Translatom"-Datenset. Dies zeigt nicht nur, was die Zelle herstellen könnte, sondern auch, was sie in diesem Moment tatsächlich produziert.

Polysom-Profilierungsexperiment auf einen Blick (Nguyen HL et al., 2019)

Ein stabiler Start: Eine präzise Übersetzungsaufnahme festhalten

Die Anfangsphase von jedem Polysom-Profiling Das Protokoll ist entscheidend. Das Ziel ist es, den natürlichen Zustand der Proteinsynthese in Zellen sofort zu bewahren. Für Forscher bedeutet dies, einen echten Schnappschuss der translationalen Aktivität festzuhalten, bevor zelluläre Störungen die Ergebnisse verändern. Unser technischer Audit 2023 hat ergeben, dass 90 % der gescheiterten Polysomen-Experimente auf Inkonsistenzen im ersten Stabilisierungsschritt zurückzuführen sind.

Phase 1: Zellbehandlung und Lyse zur Stabilisierung der Ribosomen

Das Hauptziel besteht darin, alle Ribosomen auf ihren mRNA-Tracks in ihren aktuellen Positionen "einzufrieren", um jegliche Verschiebungen im Übersetzungszustand nach der Ernte zu verhindern.

• Cycloheximid-Vorbehandlung: Fügen Sie ein bis zwei Minuten vor der Zellernte Cycloheximid direkt zum Kulturmedium hinzu, um eine Endkonzentration von 100 µg/mL zu erreichen. Dieser Inhibitor blockiert die Ribosomen-Translokation und sperrt die Ribosomen effektiv an die mRNA.
• Schnelles Kühlen und Waschen: Stellen Sie die Kulturplatte sofort auf Eis. Spülen Sie die Zellen schnell zweimal mit eisgekühltem PBS, das ebenfalls 100 µg/mL Cycloheximid enthält. Dieser Schritt entfernt verbleibendes Medium und hält die Hemmung aufrecht.
• Zelllyse: Fügen Sie ein angemessenes Volumen eines speziellen Zelllysepuffers hinzu (siehe Formulierung unten). Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen zu lösen, und übertragen Sie das Lysat sofort in ein vorgekühltes 1,5 mL Röhrchen.

Lysatpufferformulierung (Frisch zubereiten und auf Eis lagern)

Ein sorgfältig ausgewogenes Lysepuffer ist für den Erfolg unerlässlich. Seine Komponenten arbeiten zusammen, um die Integrität des Komplexes aufrechtzuerhalten.

• 10 mM Tris-HCl (pH 7,4)
• 150 mM NaCl
• 5 mM MgCl₂ – Essenziell für die Aufrechterhaltung der ribosomalen Struktur.
• 1% Triton X-100 oder NP-40 – Ein sanftes Detergens zum Aufbrechen von Zellmembranen.
• 1 mM DTT – Verhindert die Oxidation empfindlicher Komponenten.
• 100 µg/mL Cycloheximid – Hält die Ribosomen in der Stauung.
• RNAsin^® Ribonuklease-Inhibitor (40 U/mL) – Kritisch zum Schutz von RNA vor Abbau.

Klarstellung Spin

Zentrifugieren Sie den Lysat bei 4 °C für 10 Minuten bei 12.000-16.000 x g. Dies pelletierrt Zellkerne, Mitochondrien und andere Organellen. Der resultierende Überstand – Ihr zytoplasmatischer Lysat – enthält die Polysomen. Wichtig ist, diesen Überstand vorsichtig in ein neues kaltes Röhrchen zu übertragen, ohne das Pellet zu stören.

Phase 2: Trennung des Signals mittels Sukrosegradientenzentrifugation

Das Hauptziel dieser Phase besteht darin, einzelne Ribosomen von Polysomen sauber zu trennen, basierend auf ihren unterschiedlichen Dichten. Diese physische Trennung bildet die Grundlage des gesamten Protokolls zur Polysom-Profilierung und ermöglicht eine präzise Analyse der Übersetzungszustände. Eine erfolgreiche Trennung liefert ein klares Profil, aus dem die genaue Übersetzungseffizienz berechnet werden kann.

Vorbereitung des linearen Saccharosegradienten

Dieser Schritt schafft das notwendige Dichteumfeld für die Trennung. Präzision ist hierbei entscheidend für ein hochauflösendes Ergebnis.

• Bereiten Sie einen linearen Sucrosegradienten von 10 % bis 50 % mit einem Gradientenersteller oder durch sorgfältiges Schichten der Saccharoselösung vor.
• Der Saccharose muss in einem speziellen Gradientenpuffer gelöst werden, der Folgendes enthält:
  • 50 mM Tris-Acetat (pH 7,5)
  • 50 mM NH₄Cl
  • 12 mM MgCl₂ (kritisch für die Integrität der Ribosomen)
• Der Prozess muss sanft sein, um ein Mischen der Schichten zu vermeiden. Dies erfolgt typischerweise in ~12 mL Ultrazentrifugentuben.

Probenbeladung: Ein empfindlicher Vorgang

Der klärte Zelllysat wird nun vorsichtig auf die Oberseite des vorbereiteten Gradienten aufgetragen.

• Verwenden Sie ungefähr 500 µL Lysat, mit einem A260-Absorptionswert idealerweise zwischen 5 und 10.
• Das Laden muss langsam und sanft erfolgen, um eine Störung der scharfen Gradientenoberfläche zu verhindern, die für eine klare Trennung unerlässlich ist.

Ultrazentrifugation: Die endgültige Trennung

Hier findet die eigentliche Fraktionierung unter immensem Gravitationsdruck statt.

• Verwenden Sie eine Ultrazentrifuge mit einem Schwenkrührer (wie eine Beckman SW41 Ti).
• Zentrifugieren bei 4 °C bei etwa 235.000 x g für 1,5 bis 2 Stunden.
• Unter diesen Bedingungen sedimentieren schwerere Polysomen weiter in das Gradient, während leichtere Einzelribosomen (80S) und Untereinheiten höher absetzen und deutliche, sichtbare Bänder bilden.

Zuckerdichtegradienten-Vorbereitung und Ultrazentrifugation (Chassé H et al., 2017)

Phase 3: Fraktionensammlung und Echtzeit-Profiling

Die endgültige experimentelle Phase verwandelt die separierten ribosomalen Komplexe in analysierbare Daten. Das Hauptziel besteht darin, das Gradient systematisch in verschiedene Fraktionen zu sammeln und dabei ein klassisches Polysomenprofil zu erzeugen. Diese UV-Spur dient als primäres Qualitätskontrollmaß und als direkte visuelle Darstellung des translationalen Zustands der Zelle.

Bruchsammlung: Präzision von unten nach oben

Dieser Prozess erfordert spezielle Geräte, um die während der Zentrifugation erreichte Trennung aufrechtzuerhalten.

• Verwenden Sie ein Dichtegradienten-Fraktionierungssystem, das den Boden des Röhrchens durchdringt.
• Eine dichte Verschiebungslösung (z. B. 60% Saccharose) wird eingeführt und drückt sanft den gesamten Gradient von unten nach oben.
• Ein automatisierter Sammler erfasst sequenzielle Fraktionen (typischerweise 12-15) basierend auf Zeit oder Tropfenzahl und erfasst die gesamte Trennung.

Echtzeit-UV-Überwachung: Das Polysom-Profil

Während die Fraktionen gesammelt werden, bietet ein UV-Monitor eine sofortige, visuelle Darstellung der Ergebnisse.

• Die Absorbanz wird bei 254 nm gemessen, einer Wellenlänge, die ideal zur Detektion von RNA ist.
• Das resultierende Profil zeigt eine Sequenz von Peaks: die 40S- und 60S-ribosomalen Untereinheiten oben, gefolgt von dem ausgeprägten 80S-Monosom-Peak und schließlich einer Reihe größerer Peaks, die Disomen, Trisomen und schwerere Polysomen repräsentieren.
• Ein hochwertiges Profil, das für eine zuverlässige Analyse der Übersetzungs-effizienz entscheidend ist, zeigt scharfe, gut getrennte Spitzen, die auf ein erfolgreiches Polysom-Profilierungsprotokoll und eine gesunde, intakte Probe hinweisen.

Phase 4: RNA-Rückgewinnung und Qualitätskontrolle

Die endgültige Wet-Lab-Phase konzentriert sich auf die Isolierung von hochqualitativem RNA aus den gesammelten Fraktionen für die nachgelagerte Analyse. Das Hauptziel besteht darin, intakte, nicht degradierte RNA effizient zu extrahieren, da ihre Qualität den Erfolg von Sequenzierung oder qPCR direkt bestimmt. In unserer Überprüfung interner Daten aus dem Jahr 2023 haben wir festgestellt, dass Proben mit einem RIN >8,0 50 % mehr nutzbare Sequenzierungsreads für die Berechnung der Translationseffizienz lieferten.

Fraktionierung und RNA-Isolierung

Basierend auf dem UV-Profil werden Fraktionen zunächst in logische Gruppen zusammengefasst, typischerweise in "Monosom"- und "Polysom"-Pools, um die Analyse zu vereinfachen.

• Die RNA-Extraktion selbst ist ein kritischer, mehrstufiger Prozess:
  • Ribosomendissociation: Fügen Sie 1% SDS und 20 mM EDTA zu jeder Fraktion hinzu. EDTA chelatiert Mg²⁺, wodurch Ribosomen zerlegt werden, um mRNA freizusetzen, während SDS Proteine denaturiert.
  • Säure-Phenol:Chloroform-Extraktion: Fügen Sie ein gleiches Volumen Säure-Phenol:Chloroform (pH 4,5) hinzu, vortexen Sie kräftig und zentrifugieren Sie, um die Phasen zu trennen.
  • Niederschlag: Übertragen Sie die obere wässrige Phase vorsichtig in ein neues Röhrchen. Fügen Sie ein gleiches Volumen Isopropanol und 1 µL Glykogen als Ko-Niederschlagshilfsmittel hinzu, um das Pellet sichtbar zu machen. Fälllen Sie die RNA über Nacht bei -20 °C aus.
  • Waschen und Wiederauflösen: Am nächsten Tag das RNA-Pellet durch Zentrifugation gewinnen, mit 75 % Ethanol waschen und das Pellet an der Luft trocknen. Schließlich das reine RNA in RNase-freiem Wasser wiederauflösen.

Strenge Qualitätsbewertung

Die Integrität der extrahierten RNA ist nicht verhandelbar.

• Verwenden Sie ein System wie den Agilent 2100 Bioanalyzer oder einen Fragment Analyzer für eine objektive Bewertung.
• Eine hochwertige Probe zeigt scharfe, deutliche Peaks von 18S- und 28S-ribosomaler RNA.
• Die RNA-Integritätszahl (RIN) sollte größer als 8,0 sein, um sicherzustellen, dass die mRNA intakt und für eine zuverlässige Translationsanalyse geeignet ist.

Für die Qualitätskontrolle von Polysom-Sequenzierungsexperimenten beziehen Sie sich bitte auf „Qualitätskontrolle in Polysom-Sequenzierungsexperimenten.

Phase 5: Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung

Die letzte Phase verwandelt die gereinigte RNA in ein Format, das für das Hochdurchsatz-Sequenzieren bereit ist. Dieser Prozess ist entscheidend für die Generierung der Daten, die eine detaillierte Übersetzungsanalyse und eine genaue Berechnung der Übersetzungseffizienz ermöglichen. Das Hauptziel besteht darin, Sequenzierungsbibliotheken zu erstellen, die das mRNA aus verschiedenen Polysomenfraktionen treu repräsentieren.

rRNA-Depletion: Das Signal vom Rauschen trennen

Der erste und wichtigste Reinigungsschritt besteht darin, ribosomale RNA (rRNA) zu entfernen, die die Probe dominieren kann.

• Da 80-90 % der extrahierten RNA nicht-informative rRNA ist, muss sie entfernt werden, um die Sequenzierungskraft auf mRNA zu konzentrieren.
• Dies wird typischerweise mit kommerziellen Kits wie Ribo-Zero erreicht, die rRNA-Sequenzen selektiv abbauen.
• Dieser Schritt erhöht dramatisch den Anteil an bedeutungsvollen, mRNA-abgeleiteten Daten.

Bibliothekskonstruktion: Erstellung der Sequenzierungsvorlage

Die rRNA-depletierte RNA wird dann mit einem standardmäßigen, strandspezifischen Kit in eine sequenzierungsbereite Bibliothek umgewandelt.

• Der Prozess umfasst eine Reihe von enzymatischen Schritten:
• RNA-Fragmente (falls für das spezifische Protokoll erforderlich).
• Reverse Transkription zur Erstellung von Einzelstrang-cDNA.
• Synthese des zweiten cDNA-Strangs.
• Endreparatur, A-Tailing und Adapterligierung.
• PCR-Amplifikation zur Anreicherung erfolgreich ligierter Fragmente.

Sequenzierung und Qualitätskontrolle

Die endgültigen Bibliotheken werden rigoros quantifiziert und auf Qualität überprüft, bevor sie sequenziert werden.

• Bibliotheken werden auf Plattformen wie dem Illumina NovaSeq 6000 betrieben.
• Eine gängige Konfiguration ist das Pair-End-Sequencing mit 150 Basenpaaren (PE150), das eine ausreichende Leselänge und Genauigkeit für eine robuste Ausrichtung und Analyse bietet.
• Dies generiert die Rohdaten, die erforderlich sind, um zu bestimmen, welche mRNAs in den Monosom- bzw. Polysomfraktionen vorhanden waren, das grundlegende Maß zur Bewertung der translationalen Aktivität.

Von Daten zu Entdeckungen: Analyse Ihrer Polysomenprofilierungsergebnisse

Der Weg von Rohsequenzierungsdaten zu biologischen Erkenntnissen ist der Punkt, an dem die Kraft des Polysom-Profilings voll zur Geltung kommt. Nach der ersten Qualitätskontrolle und der Ausrichtung Ihrer Sequenzierungsreads an einem Referenzgenom beginnt die Kernanalyse. Das grundlegende Prinzip besteht darin, die Häufigkeit jeder mRNA in den schweren, aktiv translatierten Polysomfraktionen mit ihrer Präsenz in der Einzelribosomenfraktion (80S) zu vergleichen.

Dieser Vergleich ermöglicht es Ihnen, einen Übersetzungseffizienz (TE) Score für jedes Gen zu berechnen. Durch die Analyse dieser Polysom-Sequenzierungsdaten können Sie systematisch Gene mit signifikanten Veränderungen in ihrer translationalen Regulation identifizieren, unabhängig von ihren gesamten mRNA-Spiegeln. Dies offenbart eine verborgene Ebene der Genexpressionskontrolle, die entscheidend für das Verständnis zellulärer Reaktionen bei Krankheiten und Behandlungen ist.

Bitte beachten Sie: Dieses Protokoll ist ein allgemeines Verfahren. Spezifische experimentelle Parameter (z. B. Zentrifugationskraft, Zeit und Reagenzkonzentrationen) sollten basierend auf dem spezifischen Zelltyp und den Forschungszielen optimiert werden. Alle Arbeiten sollten in einer sterilen, RNase-freien Umgebung durchgeführt werden.

Um die Rolle der Polyribosomen-Sequenzierung zu verstehen, beziehen Sie sich bitte auf die Einführung zu "Polysomsequenzierung und ihre Rolle bei der translationalen Kontrolle.

Um den Unterschied zwischen Polysom-Profiling und Ribosomen-Profiling zu verstehen, können Sie sich auf "Polysom-Profilierung vs. Ribosomen-Profilierung: Wichtige Unterschiede und Anwendungen.

Referenzen:

1. Chassé H, Boulben S, Costache V, Cormier P, Morales J. Analyse der Translation mittels Polysom-Profiling. Nukleinsäuren Forschung2017 Feb 17;45(3):e15.
2. Nguyen HL, Duviau MP, Cocaign-Bousquet M, Nouaille S, Girbal L. Multiplexierung von Polysom-Profilierungsexperimenten zur Untersuchung der Translation in Escherichia coli. PLoS One2019, 19. Februar; 14(2):e0212297.
3. Pringle ES, McCormick C, Cheng Z. Polysom-Profilerstellung von mRNA und assoziierten Proteinen, die an der Translation beteiligt sind. Curr Protoc Mol Biol2019 Jan;125(1):e79.
4. Karamysheva ZN, Tikhonova EB, Grozdanov PN, Huffman JC, Baca KR, Karamyshev A, Denison RB, MacDonald CC, Zhang K, Karamyshev AL. Polysom-Profilierung in Leishmania, menschlichen Zellen und Maus-Hoden. J Vis Exp2018 Apr 8;(134):57600.