Anwendungen von Iso-Seq in der Genomik und Transkriptomik-Forschung

Iso-Seq Technologie, entwickelt von Pacific Biosciences, ist ein Verfahren zur Sequenzierung des vollständigen Transkriptoms, das auf basiert in PacBio Einzelmolekül-Echtzeit-Sequenzierung (SMRT) Technologie. Sie sequenziert direkt vollständige cDNA, ohne RNA-Moleküle zu fragmentieren, was die Erzeugung von hochwertigen vollständigen Transkriptlängen ermöglicht, die bis zu 10 kb oder sogar länger sein können. Der Hauptvorteil von Iso-Seq liegt in seiner Fähigkeit, vollständige Transkriptinformationen bereitzustellen, die die 5' untranslatierte Region (5'UTR), die 3' untranslatierte Region (3'UTR) und den polyA-Schwanz umfassen. Dies umgeht die komplexen Prozesse der Transkript-Splicing und Rekonstruktion, die in der traditionellen RNA-seq-Technologie vorhanden sind.

Iso-Seq kann biologische Phänomene wie alternative Spleißereignisse, alternative Start- und Stoppsites, Fusionsgene und lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs) präzise identifizieren. Dies bietet eine neuartige Perspektive zur Untersuchung der Regulierung der Genexpression, der Komplexität des Transkriptoms und der Genfunktion. Darüber hinaus ist Iso-Seq aufgrund seiner Fähigkeit, vollständige Transkripte abzudecken, besonders gut geeignet für das Studium von Arten ohne Referenzgenom. Es kann Transkript-Isomere und neue Gene aufdecken, die traditionelle RNA-Seq Methoden haben versagt, um zu erkennen.

Überblick über die Bedeutung von Iso-Seq in der Biologie

Die Iso-Seq-Technologie hat eine bedeutende Rolle in Genomik und Transkriptomik Forschung aufgrund seiner Fähigkeiten zur Sequenzierung vollständiger Transkripte. Es verbessert nicht nur die Genauigkeit der Genomanalyse, sondern offenbart auch die Komplexität des Transkriptoms, fördert die Entdeckung neuer Gene und Transkripte und bietet ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung von Nicht-Referenzgenomarten.

Verbesserung der Genauigkeit der Genomannotation: Die Iso-Seq-Technologie erzeugt vollständige Transkripte, die eine direkte Bestimmung von Exon-Grenzen, Spleißstellen und alternativen Spleißstellen ermöglichen. Dies führt zu einer genaueren Genannotation. Zum Beispiel haben die vollständigen Transkripte, die durch Iso-Seq in pflanzlichen Transkriptomstudien gewonnen wurden, die Verfeinerung von Genmodellen erheblich verbessert. Darüber hinaus kann Iso-Seq Fusionsgene und Methylierungsstellen identifizieren, was die verfügbaren Informationen für die Genomannotation weiter ergänzt.

Die Komplexität des Transkriptoms aufdecken: Die Iso-Seq-Technologie ermöglicht eine umfassende Analyse der komplexen Struktur des Transkriptoms, einschließlich alternativer Spleißereignisse, nicht-kodierender RNAs, mRNA-Abbau (NMD) und Polyadenylierung. In Studien an Säugetieren hat Iso-Seq beispielsweise zahlreiche neue Gene und Transkripte entdeckt, die im Referenztranskriptom nicht erfasst waren, was ihre Überlegenheit bei der Erforschung der Komplexität des Transkriptoms unterstreicht.

Förderung der Entdeckung neuer Gene und neuer Transkripte: Die Fähigkeit von Iso-Seq, vollständige Sequenzen zu erzeugen, bietet einen klaren Vorteil bei der Entdeckung neuer Gene und Transkripte. In der Sojabohnenforschung deckten Iso-Seq-Daten über 80 % der durch RNA-Seq identifizierten Genstandorte ab und entdeckten viele neuartige Gene. Darüber hinaus wurde Iso-Seq verwendet, um die Expression von Pseudogenen bei Säugetieren zu erkennen, was Einblicke in die Rolle von Pseudogenen in den Entwicklungsdynamiken gibt.

Anwendungen in der Genomik

Genentdeckung und Annotation

a) Identifizierung neuer Gene und Isoformen

Die Entdeckung von Genen ist eine grundlegende Aufgabe in der Genomforschung. Moderne bioinformatische Software ermöglicht es Forschern, Gene aus Genomsequenzen effizient zu identifizieren, insbesondere bei Prokaryoten wie Bakterien, Archaeen und Viren, wo der Prozess relativ unkompliziert und genau ist.

Künstliche Intelligenz-Technologien, insbesondere Deep-Learning-Algorithmen, spielen eine entscheidende Rolle bei der Genomannotation. Diese Algorithmen verbessern die Genauigkeit und Geschwindigkeit der Genvorhersage. Zum Beispiel kann der duale Genomalgorithmus durch die Integration statistischer Informationen mit Vergleichen zu bekannten kodierenden Sequenzen neue Genregionen präzise lokalisieren.

Differenzielle Expressionsanalyse von lncRNA (Zhang et al., 2022)

b) Verfeinerung von Genmodellen

Die Genannotation umfasst nicht nur die Bestimmung des Standorts von Genen, sondern auch die genaue Definition ihrer inneren Strukturen, wie Introns und Exons. Dieser Prozess erfordert typischerweise die Integration verschiedener computergestützter Methoden, einschließlich Sequenzvergleichen mit bekannten Gen-Datenbanken und der Optimierung der Annotationsergebnisse mithilfe von maschinellen Lernalgorithmen. Die genomweite Annotation ist besonders wichtig nach Abschluss der Genomsequenzierung neuer Arten, da sie eine Grundlage für nachfolgende funktionale Forschungen bietet.

Vergleichende Genomik

a) Kreuzspeziesanalyse von Genstrukturen

Die vergleichende Genomik umfasst den Vergleich von Genomsequenzen verschiedener Arten, um evolutionäre Beziehungen und konservierte Elemente aufzudecken. Dieser Ansatz hilft nicht nur, Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen Arten zu identifizieren, sondern unterstützt auch das Verständnis der Expansion und Kontraktion von Genfamilien. Zum Beispiel können Forscher durch die Analyse der kodierenden Regionen von BPI-Genen in mehreren Arten deren genetische Vielfalt und funktionale Unterschiede zwischen verschiedenen Organismen untersuchen.

b) Evolutionäre Erkenntnisse

Die vergleichende Genomik bietet ein leistungsstarkes Werkzeug zum Verständnis der Evolution von Arten. Durch die Analyse des TCTP-Proteins in verschiedenen Arten haben Forscher dessen funktionale Differenzierung und evolutionäre Entwicklung aufgeklärt. Mechanismen der Genreplikation, wie Crossover, Inversion und Chromosomenmultiplikation, spielen ebenfalls eine bedeutende Rolle in der Evolution und erleichtern das Entstehen neuer Funktionen. Durch den Vergleich von Genomdaten verschiedener Arten können Forscher die Auswirkungen der Genomselektion auf die Variabilität von Merkmalen untersuchen.

Die Entdeckung von Genen, deren Annotation und vergleichende Genomik finden in der modernen Lebenswissenschaftsforschung breite Anwendung. In Bereichen wie Medizin, Landwirtschaft und Umweltwissenschaften können Forscher durch Genomannotation und vergleichende Analysen ein besseres Verständnis für Genexpressionsmuster, krankheitsbedingte genetische Variationen und die genetischen Grundlagen komplexer Merkmale gewinnen. Mit dem Fortschritt in der Hochleistungsrechner- und Cloud-Computing-Technologie ist die Verarbeitung von großangelegten Genomdaten effizienter geworden, was die Forschung in diesen Bereichen weiter vorantreibt. Diese Aspekte der Genomforschung treiben nicht nur den Fortschritt der Grundlagenwissenschaften voran, sondern bieten auch entscheidende Unterstützung für klinische Diagnosen, die Arzneimittelentwicklung und biotechnologische Anwendungen.

Die L1-lncRNA LINC01876 ist ein menschenspezifisches Transkript (Raquel et al., 2023).

Anwendungen in der Transkriptomik

A. Studien zur alternativen Spleißung

a) Identifizierung von Spleißvarianten

Alternative Splicing ist ein Prozess, bei dem ein einzelnes Gen mehrere mRNA-Isoformen durch unterschiedliche Spleißmuster erzeugt, wodurch die Vielfalt der Genexpression erhöht wird. Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien, wie RNA-Seq, bieten eine robuste Möglichkeit, alternative Spleißung umfassend zu untersuchen. rMATS ist beispielsweise ein statistisches Verfahren, das verwendet wird, um differenzielle alternative Spleißung in repetitiven RNA-Seq-Daten zu erkennen und zu quantifizieren. Es kann gepaarte Proben, wie z. B. Fall-Kontroll-Studien, verarbeiten und individuelle Variationen berücksichtigen. Werkzeuge wie IsoformSwitchAnalyzeR können auch Spleißvarianten vorhersagen, indem sie Änderungen an Spleißstellen berechnen.

b) Funktionale Implikationen alternativer Isoformen

Alternatives Spleißen fügt nicht nur Komplexität zum Transkriptom hinzu, sondern kann auch die Proteinfunktion beeinflussen. Einige alternative Isoformen können spezifische biologische Funktionen besitzen, wie die Regulierung der Genexpression. In der Krebsforschung wurde gezeigt, dass alternatives Spleißen zur Krankheitsentwicklung beiträgt, indem es die Proteinstruktur und -funktion verändert. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass alternative Spleißereignisse stark gewebespezifisch sind und die Zellfunktion erheblich beeinflussen können.

Alternative Spleißung ist in betroffenen Hirnregionen bei CAG-Expansion SCA-Mausmodellen dysreguliert (Hannah et al., 2024).

B. Transkriptom-Profiling

a) Quantitative Analyse der Isoformexpression

Eine wichtige Anwendung der Transkriptomanalyse ist die quantitative Bewertung der Isoform-Expressionsniveaus. Dies basiert typischerweise auf RNA-Seq-Daten und wird erreicht, indem Reads über Spleißstellen hinweg identifiziert werden. Der MISO-Algorithmus kann beispielsweise die relativen Expressionsniveaus verschiedener Isoformen messen, die aus Exon-Skipping-Ereignissen resultieren. Eine Vielzahl von rechnerischen Ressourcen und statistischen Methoden wurde entwickelt, um die Transkriptom- und Isoformvielfalt zu berechnen.

b) Unterschiedliche Isoformnutzung unter verschiedenen Bedingungen

Alternatives Spleißen zeigt signifikante Unterschiede in der Isoformnutzung unter verschiedenen Bedingungen. Während der Entwicklung beispielsweise nimmt die Häufigkeit von alternativen Spleißereignissen erheblich zu. Einige Studien haben auch gezeigt, dass alternatives Spleißen in Krankheitszuständen, wie Krebs, signifikante Veränderungen durchläuft, die neue Biomarker für die Diagnose und Behandlung von Krankheiten bieten könnten.

Heatmap der 50 am stärksten differentiell exprimierten Gene zwischen frühen und späten Phasen der Samenkentwicklung in S. tora (Kang et al., 2020)

Alternative Spleißung und Transkriptomanalyse sind wesentliche Werkzeuge in der modernen biologischen Forschung. Sie decken nicht nur die Komplexität der Genexpression auf, sondern bieten auch eine neue Perspektive für das Verständnis der Genfunktion und der Krankheitsmechanismen. Durch die Kombination Hochdurchsatz-Sequenzierung Mit Technologien und fortschrittlichen bioinformatischen Werkzeugen können Forscher umfassendere Analysen des alternativen Spleißens und seiner Veränderungen unter verschiedenen Bedingungen durchführen, wodurch die Entwicklung der Grundlagen- und klinischen Forschung gefördert wird.

Fallstudien zu Iso-Seq

Erfolgreiche Iso-Seq-Anwendungen in veröffentlichten Studien

Transkriptomforschung bei Pflanzen: Die Iso-Seq-Technologie hat bemerkenswerte Vorteile in der Transkriptomforschung bei Pflanzen gezeigt. Durch PacBio Iso-Seq können Forscher vollständige Transkripte erzeugen, wodurch die Probleme vermieden werden, die mit der Transkriptomrekonstruktion aufgrund der kurzen Leselängen traditioneller RNA-Seq verbunden sind. Dies ermöglicht es Iso-Seq, bei der Genannotation und der Entdeckung neuer Gene gut abzuschneiden. Identifizierung von langen nicht-kodierenden RNAs (lncRNAs)und die Erkennung von Spleißisomeren.

Zusammenfassung der Iso-Seq-Daten (Liu et al., 2022)

Verbesserung der Genomannotation: In der Studie über Modellpflanzen wie Arabidopsis thaliana wurde die Genomannotation von TAIR10 mithilfe der Iso-Seq-Technologie erneut analysiert, wodurch erfolgreich fast 60 % des Genmodells wiederhergestellt und neue Genloci identifiziert wurden. Dieses Ergebnis unterstreicht die Fähigkeit von Iso-Seq, die Genauigkeit und Vollständigkeit der Genomannotation erheblich zu verbessern.

Transkriptomanalyse von Nicht-Modellpflanzen: Forschungen zu Halogeton glomeratus haben gezeigt, dass die Iso-Seq-Technologie vollständige Transkriptomdaten liefern und die komplexen molekularen Mechanismen der Salzstressreaktionen von Pflanzen aufdecken kann. Dies ist von großer Bedeutung für die Züchtung von salztoleranten Pflanzen.

Anwendung in der Krebsforschung: Die Iso-Seq-Technologie wird umfassend in der Krebsforschung eingesetzt. Durch die Sequenzierung von Voll-Längen-RNA kann sie die Heterogenität von Tumorzellen und Genexpressionsmuster aufdecken. Zum Beispiel ermöglicht die Kombination des Kinnex-Voll-Längen-RNA-Kits mit der Iso-Seq-Technologie Forschern, hochwertige Krebs-Transkriptomdaten zu erhalten, die neue Einblicke in die Krebsbehandlung bieten.

Agrarbiotechnologie: In der Weizenforschung hat die Integration der TeloPrime-Technologie mit Iso-Seq-Sequenzierung es Forschern ermöglicht, eine hochwertige Genomannotationsbibliothek für hexaploiden Weizen zu erstellen. Dies bietet entscheidende Unterstützung für zukünftige Forschungen zur Genfunktion von Weizen und zur Züchtung.

Vorhersage der Funktionen von Iso-Seq-Isoformen in G. purpurascens (Abdul et al., 2024)

Auswirkungen auf die biomedizinische Forschung und Pflanzenzüchtung

Die Anwendungen von Iso-Seq in der biomedizinischen Forschung und der Pflanzenzüchtung haben einen erheblichen Einfluss auf diese Bereiche gehabt. In der biomedizinischen Forschung hat Iso-Seq das Potenzial, neue Biomarker und therapeutische Ziele für eine Vielzahl von Krankheiten zu identifizieren, einschließlich Krebs, neurologischen Störungen und Autoimmunerkrankungen. Durch die Bereitstellung eines umfassenderen und genaueren Bildes des Transkriptoms kann Iso-Seq Forschern helfen, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Krankheitsentwicklung und -progression zugrunde liegen.

Biomedizinische Forschung: In der biomedizinischen Forschung hat Iso-Seq das Potenzial, neue Biomarker und therapeutische Ziele für verschiedene Krankheiten zu identifizieren, einschließlich Krebs, neurologischer Störungen und Autoimmunerkrankungen. Durch die Bereitstellung einer umfassenderen und genaueren Sicht auf das Transkriptom hilft Iso-Seq Forschern, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Krankheitsentwicklung und -progression zugrunde liegen. Die Sequenzierung von Voll-Längen-RNA ermöglicht eine präzisere Identifizierung von krankheitsbezogenen Spleißvarianten, Fusionsgenen und Mutationsstellen, was für das Verständnis von Krankheitsmechanismen und die Bereitstellung von Datenunterstützung für die personalisierte Medizin von Vorteil ist.

Pflanzenzüchtung: In der Pflanzenzüchtung hilft die Iso-Seq-Technologie Forschern, die genetischen Regulationsnetzwerke von Pflanzen besser zu verstehen, indem sie umfassende Transkriptomdaten bereitstellt. In der Baumwollforschung hat die Analyse der dynamischen Veränderungen des Transkriptoms unter verschiedenen abiotischen Stressfaktoren die Reaktionsmechanismen von Baumwolle auf Trockenheit, Salinität und andere Stressfaktoren aufgezeigt und wichtige molekulare Marker für die Züchtung geliefert.

Iso-Seq schließt Lücken in Transkripten, die für Samenlagerproteine kodieren (Zhang et al., 2024)

Verbesserung der Genauigkeit der Genomannotation: Die Iso-Seq-Technologie verbessert die Genauigkeit der Genomannotation erheblich, indem sie vollständige Transkripte erzeugt. In der Forschung zu Sojabohnen (Glycine max) hat Iso-Seq über 80 % der Genloci aufgedeckt und zahlreiche allelische Variationen entdeckt, was die Grundlage für die genetische Verbesserung von Sojabohnen und die Forschung zu funktionalen Genen legt.

Förderung der Entwicklung der funktionellen Genomik von Pflanzen: Die Anwendung der Iso-Seq-Technologie hat die Entwicklung der funktionellen Genomik von Pflanzen erheblich vorangetrieben. In der Reisforschung hat die Kombination von Short-Read-RNA-Seq- und Iso-Seq-Daten es den Forschern ermöglicht, eine umfassendere Genexpressionskarte zu erstellen, die eine wichtige Referenz für die molekulare Züchtung von Reis bietet.

Förderung des Schutzes der landwirtschaftlichen Biodiversität: Die Iso-Seq-Technologie spielt auch eine entscheidende Rolle beim Schutz der landwirtschaftlichen Biodiversität. In der Mango-Forschung hilft die Analyse der Genomassoziationskartierung mit Hilfe der Iso-Seq-Technologie den Forschern, die genetischen Grundlagen der Fruchtqualität und der Stressresistenz besser zu verstehen, was eine wissenschaftliche Grundlage für die genetische Verbesserung von Mangos bietet.

Fazit

Iso-Seq stellt einen bedeutenden Fortschritt in den Bereichen Genomik und Transkriptomik dar und bietet unvergleichliche Möglichkeiten zur Identifizierung neuer Gene und Isoformen, zur Verfeinerung von Genmodellen und zur detaillierten Analyse von Genstrukturen über verschiedene Arten hinweg. Innerhalb der Genomik erleichtert Iso-Seq die Entdeckung neuer genetischer Elemente und verbessert die Genauigkeit von Genannotationen.

Im Bereich der Transkriptomik liefert es entscheidende Einblicke in alternative Spleißmechanismen und die regulatorischen Landschaften der Genexpression. Darüber hinaus wurde Iso-Seq zunehmend in der Pflanzenforschung, Onkologie und landwirtschaftlichen Biotechnologie angewendet, wo es komplexe Wege der Genregulation aufdeckt, Tumoreigenschaften erläutert und bei der Erstellung hochpräziser Genomannotationen hilft.

In die Zukunft blickend, verspricht die Integration von Iso-Seq mit zusätzlichen Omics-Datensätzen umfassende biologische Erkenntnisse zu liefern. Die potenziellen klinischen Anwendungen, insbesondere im Bereich der Krankheitsdiagnose und therapeutischen Interventionen, erscheinen vielversprechend. Darüber hinaus markiert die Nützlichkeit von Iso-Seq zur Förderung einer nachhaltigen Pflanzenzüchtung einen bedeutenden Fortschritt. Daher ist Iso-Seq gut positioniert, um in absehbarer Zeit wesentliche Beiträge im Bereich der wissenschaftlichen Forschung zu leisten.

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