Die Kraft von BSA: Fortschritte in der Forschung zur Merkmalslokalisierung

BSA (Bulk-Segregant-Analyse), auch als Hybridgruppenanalyse bezeichnet, ist eine schnelle und einfache Methode zur Lokalisierung von Merkmalen, die in den letzten Jahren entstanden ist. Eine der herausragenden Eigenschaften von BSA ist die Pool-Sequenzierung der Nachkommen von zwei extremen Merkmalen. Allerdings, BSA ist nicht so einfach wie das Mischen von Sequenzen. In praktischen Anwendungen gibt es verschiedene Methoden, um die Unterschiede in den Populationen und im experimentellen Design zu beheben.

Was ist BSA (Bulked Segregant Analysis)?

BSA (Bulked Segregant Analysis), ursprünglich 1991 von R.W. MICHELMORE eingeführt, hat sich als leistungsstarke Methode zur schnellen Identifizierung von Genen, die spezifische Merkmale steuern, etabliert. Das Grundprinzip besteht darin, Eltern auszuwählen, die erhebliche phänotypische Unterschiede aufweisen, um eine segregierende oder Familienpopulation zu schaffen, die dem Studium des Zielmerkmals gewidmet ist. Anschließend werden eine bestimmte Anzahl von Einzelpflanzen mit extremen Phänotypen für das Merkmal aus der segregierenden Population ausgewählt und kombiniert, um zwei DNA-"Pools" zu erstellen. Die kontrastierenden genetischen Variationen innerhalb dieser Pools weisen auf den potenziellen Kandidatenbereich hin, in dem sich das interessierende Gen oder QTL befinden könnte. Typischerweise wird die DNA beider Elternteile als Kontrolle verwendet, um die Unterschiede zwischen den beiden DNA-Pools zu vergleichen, was eine umfassende Analyse und genaue Interpretation der experimentellen Ergebnisse ermöglicht.

Bitte beziehen Sie sich auf Bulk-Segregant-Analyse Fragen & Antworten für weitere Informationen.

Bulked-Segregant-Analyse. (Shen et al., 2022)

Wie man eine Bulked Segregant Analyse durchführt?

Gemäß der Herkunft der Zielmerkmale kann die BSA-Merkmalslokalisierung in zwei Richtungen unterteilt werden: natürliche Merkmale (QTL-seq) und künstlich mutierte Merkmale (Mutantenkarte, MutMap).

QTL-seq

QTL-seq verwendet eine Strategie, bei der Eltern mit extremen Merkmalen sorgfältig ausgewählt werden, um eine Linie zu etablieren. Die Nachkommenpopulation, die eine normale Verteilung der Zielmerkmale zeigt, wird segregiert, und Individuen, die extreme Merkmale an beiden Enden dieser Verteilung aufweisen, werden ausgewählt, um zwei äquivalente Stichprobenpools zu bilden. Diese Pools werden dann sequenziert, wobei die anschließende Analyse des SNP-Index die Identifizierung von Loci oder Regionen ermöglicht, die mit den Zielmerkmalen assoziiert sind. Primär wird diese Methode zur Identifizierung von Schlüsselfunktionsgenen verwendet, die quantitativen Merkmalen zugrunde liegen.

MutMap

MutMap umfasst die Schaffung einer familiären Population durch das Rückkreuzen von mutierten Individuen mit entweder den Eltern oder entfernt verwandten Inzuchtarten. Aus dieser segregierenden Nachkommenpopulation wird eine Teilmenge von Individuen ausgewählt, die die mutierten Merkmale aufweisen, um einen Genpool zu erzeugen. Gleichzeitig wird ein separater Genpool gebildet, der eine bestimmte Anzahl von Wildtyp-Nachkommen umfasst, um als Kontrolle für den Mutantenpool zu dienen. Die gemischten Proben aus diesen Pools werden anschließend sequenziert, und die erhaltenen Ergebnisse werden mit dem elterlichen Genom oder dem Pool von Nachkommen mit wilden Merkmalen verglichen. Durch die Untersuchung des SNP-Index werden die Loci oder Regionen, die mit den Zielmerkmalen assoziiert sind, präzise identifiziert. Diese Methode ist besonders nützlich zur Erkennung von Punktmutationen, die entweder durch chemische oder physikalische Mutagenese entstehen, und findet breite Anwendung in der Lokalisierungsforschung von Qualitätsmerkmalen.

Workflow der Bulked Segregant Analyse

• Phänotypische Selektion: Erkennen Sie ein phänotypisches Merkmal von Bedeutung, das eine deutliche Trennung zwischen zwei unterscheidbaren Klassen aufweist, wie z. B. dem Wildtyp und dem Mutanten.
• Kreuzung und Erzeugung einer segregierenden Population: Erzeugen Sie eine Population, indem Sie Individuen mit divergierenden Phänotypen kreuzen. Zum Beispiel, im Fall der Untersuchung eines Pflanzenmerkmals, paaren Sie ein mutiertes Individuum mit dem gewünschten Phänotyp mit einem Wildtyp-Individuum.
• Phänotypische Screening und Vorbereitung von Bulk-Proben: Lassen Sie die Nachkommen aus der Kreuzung wachsen und reifen. Führen Sie eine phänotypische Bewertung der Nachkommen durch, um Individuen zu identifizieren, die die gewünschten phänotypischen Extreme zeigen. Wählen Sie spezifisch eine gleiche Anzahl von Individuen mit dem mutierten Phänotyp und Individuen mit dem Wildtyp-Phänotyp aus.
• DNA-Extraktion: Extrahieren Sie genomische DNA von jedem ausgewählten Individuum in den Mutanten- und Wildtyp-Pools separat. Verwenden Sie eine geeignete DNA-Extraktionsmethode, um DNA von hoher Qualität zu erhalten.
• Pooling und Sequenzierung: Mischen Sie die extrahierte DNA aus dem Mutantenpool und dem Wildtyp-Pool einzeln, um zwei konsolidierte DNA-Proben zu erzeugen. Verwenden Sie Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologienwie z. B. Next-Generation-Sequencing (NGS), um die DNA der mutierten und der Wildtyp-Proben zu sequenzieren.
• Datenanalyse: Analysieren Sie die Sequenzierungsdaten, um genetische Variationen zu erkennen, wie z. B. einzelne Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), zwischen den mutierten und den Wildtyp-Proben. Berechnen Sie den SNP-Index, der die Allelfrequenz von SNPs in jeder konsolidierten Probe angibt. Diese Analyse wird die Identifizierung von genomischen Regionen erleichtern, die mit dem angestrebten Phänotyp assoziiert sind.
• Identifizierung von Kandidatengenen: Vergleichen Sie die SNP-Index-Werte über das gesamte Genom, um Regionen oder Loci zu identifizieren, die mit dem gewünschten Merkmal verbunden sind. Identifizieren Sie Kandidatengene innerhalb dieser Regionen, die potenziell zum beobachteten Phänotyp beitragen. Validieren Sie anschließend diese Kandidatengene durch ergänzende Experimente und funktionale Analysen.

Referenz:

1. Shen, Fei, et al. "Ein Werkzeug zur Analyse von gebündelten segregierten Linien für Kreuzungsspezies (BSATOS) und QTL-basierte genomikgestützte Vorhersage komplexer Merkmale bei Äpfeln." Zeitschrift für fortgeschrittene Forschung 42 (2022): 149-162.