Was sind Gene und Gen-Sequenzierung?

Was ist ein Gen?

Ein Gen dient als grundlegende Einheit genetischer Informationen, die in der DNA kodiert sind. Es steuert die Expression der Merkmale eines Organismus, indem es die Proteinsynthese durch die komplexen Prozesse der Transkription und Translation leitet. Im Wesentlichen bestimmen Gene die Ausprägung des genetischen Erbes eines Individuums und üben einen tiefgreifenden Einfluss auf die Merkmale aus, die ein Organismus zeigt.

Was ist Genomsequenzierung?

Genomsequenzierung enthüllt den komplexen Bauplan des Lebens, der in unseren Genen kodiert ist. Die genetische Zusammensetzung jedes Organismus, obwohl vielfältig, spiegelt letztendlich eine einzigartige Anordnung der vier grundlegenden Basen wider: Adenin (A), Thymin (T), Guanin (G) und Cytosin (C). Im Kern ist die Gen-Sequenzierung der sorgfältige Prozess, diese Sequenz zu entschlüsseln und die genaue Reihenfolge dieser Basen innerhalb eines Gens zu beleuchten.

Die Technik nutzt die Leistung eines Gen-Sequenzierers, eines komplexen Instruments, das entwickelt wurde, um die genetischen Informationen, die in der DNA eingebettet sind, zu entschlüsseln. Mit einem nuancierten Ansatz verwendet das Gen-Sequenzieren fluoreszierende Marker in verschiedenen Farben, um zwischen den vier Basen zu unterscheiden. Während das Gen durch den Sequenzierer läuft, löst ein Lasersystem die Emission von fluoreszierendem Licht aus jeder Base aus, wodurch ihre sequenzielle Anordnung sichtbar wird.

Diese emittierten Lichter, die jeweils einer bestimmten Base entsprechen, werden dann von einer spezialisierten Kamera erfasst, die die genetische Sequenz in ein visuelles Gewebe lebendiger Farben verwandelt. Durch sorgfältige Analyse dieser fluoreszierenden Signale wird die genaue Reihenfolge der Basen innerhalb des Gens entschlüsselt, was tiefgreifende Einblicke in die grundlegenden Bausteine des Lebens bietet.

Darstellung der Arabidopsis-Chromosomen. (Iniative et al., 2000)

Anwendungen der Genomsequenzierung

Die Genomsequenzierung ist allgegenwärtig geworden und revolutioniert unseren Ansatz zum Verständnis und zur Verwaltung genetischer Informationen. Diese hochmoderne Technologie analysiert und entschlüsselt die vollständige Sequenz von Genen, die aus Blut- oder Speichelproben extrahiert werden, und bietet wertvolle Einblicke in Krankheitsanfälligkeit, Verhaltensmerkmale und individualisierte medizinische Versorgung.

Mit der Fähigkeit, die Wahrscheinlichkeit verschiedener Krankheiten vorherzusagen und Verhaltensmerkmale zu erkennen, spielt die Genomsequenzierung eine entscheidende Rolle in der präventiven Gesundheitsversorgung. Durch die Identifizierung genetischer Marker, die mit bestimmten Erkrankungen in Verbindung stehen, ermöglicht sie proaktive Maßnahmen zur Verhinderung und Behandlung von Krankheiten, bevor sie auftreten.

Über 45 Jahre, Genomsequenzierung hat eine bemerkenswerte Evolution durchlaufen, die in der vierten Generation der Sequenzierungstechnologie gipfelt. Fortschritte in den Sequenzierungstechniken, zusammen mit sinkenden Kosten, haben den Zugang zu diesem transformativen Werkzeug demokratisiert und es in den Alltag integriert.

Die Anwendungen der Genomsequenzierung erstrecken sich über ein vielfältiges Spektrum von Bereichen, die sowohl Forschungs- als auch klinische Domänen umfassen. Von Multi-Omics-Studien und der Sequenzierung von Bevölkerungs-Kohorten bis hin zu Arzneimittelentwicklung, Landwirtschaft und öffentlichem Gesundheitsmanagement ist ihre Wirkung weitreichend. In der klinischen Medizin ermöglicht die Genomsequenzierung nicht-invasive pränatale Tests, unterstützt reproduktive Technologien, hilft bei der Tumordiagnose und präzisen Behandlung und ermöglicht die frühzeitige Erkennung von Infektionskrankheiten.

Heute überschreitet die Genomsequenzierung traditionelle medizinische Grenzen und findet Anwendung in der wissenschaftlichen Forschung, im Verbraucherdienst und darüber hinaus. Ihre Vielseitigkeit unterstreicht ihre entscheidende Rolle bei der Gestaltung der Zukunft des Gesundheitswesens und darüber hinaus.

Die Geschichte der Genomsequenzierung

Die Geschichte der Genomsequenzierung erstreckt sich über 45 Jahre und ist geprägt von vier Generationen technologischer Innovationen, die das exponentielle Wachstum der Branche vorangetrieben haben.

1977 entwickelte Sanger die erste Generation der Gen-Sequenzierung und legte damit die Grundlage für nachfolgende Fortschritte. Ein entscheidender Moment kam 1998 mit dem Aufkommen der Kapillarsequenzierungstechnologie, die die Sequenzierungsgeschwindigkeit verzehnfachte und den ehrgeizigen Zeitplan des Human Genome Project vorantrieb.

Der Jahrtausendwechsel läutete im Jahr 2005 die zweite Generation von Hochdurchsatz-Sequenzierern ein, die die Kosten um erstaunliche 100-fach senkten und einen Trend auslösten, der selbst das Moore'sche Gesetz übertraf und treffend als "Super-Moore'sches Gesetz" bezeichnet wurde. Diese Ära erlebte beispiellose Verbesserungen in der Sequenziergeschwindigkeit, -länge und -durchsatz.

Heute, Next-Generation-Sequenzierung (NGS) steht als Höhepunkt der kommerziellen Rentabilität und weit verbreiteten Akzeptanz. NGS revolutionierte das Sequenzieren, indem es die reversible Beendigung ungebundener Nukleotide einführte, was eine gleichzeitige Synthese und Sequenzierung mit unvergleichlicher Durchsatzrate, Präzision und Erschwinglichkeit ermöglichte. Während Innovationen wie PacBio SMRT-Sequenzierung und Nanopore-Technologien eine verbesserte Genauigkeit und Vielseitigkeit versprechen, bestehen die praktischen Herausforderungen in Bezug auf Kosten und Präzision weiterhin, was die Dominanz von NGS in absehbarer Zukunft.

Dennoch entwickelt sich die Trajektorie der Gen-Sequenzierung weiter, angetrieben von der Suche nach höherem Durchsatz, längeren Lesezeiten, größerer Genauigkeit, schnelleren Bearbeitungszeiten, verbesserter Fehlertoleranz, breiterer Anwendbarkeit und reduzierten Kosten. Mit dem Fortschritt der Technologie birgt die Landschaft der Gen-Sequenzierung grenzenloses Potenzial für transformative Fortschritte, die die Zukunft der Gesundheitsversorgung und wissenschaftlichen Entdeckung prägen werden.

Sanger-Sequenzierungstechnologie

Die Sanger-Sequenzierung, die als Goldstandard für die Mutationsdetektion und -validierung gefeiert wird, entstand 1977 als die wegweisende Kraft in der genetischen Analyse.

Dies Sanger-Sequenzierung Die Methode verwendet Elektrophorese, um DNA-Fragmente unterschiedlicher Längen zu trennen, was eine präzise Sequenzierung ermöglicht. Sie findet ihren Platz in Szenarien, die eine sorgfältige genetische Diagnose erfordern, wie zum Beispiel in familiären Linien mit klar definierten ursächlichen Genen, kleinen Stichprobenkohorten und bekannten genetischen Loci.

Die Sanger-Methode (Kettenabbruchmethode) zur DNA-Sequenzierung

Die Stärken von Sanger-Sequenzierung liegt in seiner Fähigkeit, lange Reads zu erzeugen, die bis zu 1000 Basenpaare umfassen, gepaart mit unvergleichlicher Genauigkeit, die den Maßstab für Mutationsdetektion und -validierung setzt. Die Nutzung der PCR-Amplifikation, eines routinemäßigen Laborverfahrens, erhöht die Praktikabilität. Allerdings gibt es Einschränkungen, darunter eine niedrige Durchsatzrate, prohibitive Sequenzierungskosten, komplizierte Betriebsverfahren und begrenzte Automatisierung, die es unzureichend für großangelegte Gen-Sequenzierungsprojekte machen.

Darüber hinaus unterstreicht die Unfähigkeit, große Deletionen, Unterschiede in der Genkopienanzahl und bestimmte Mutationsarten zu erkennen, die Notwendigkeit von Referenzsequenzen, was die Nützlichkeit weiter kompliziert.

NGS-Sequenzierungstechnologie

Next-Generation-Sequenzierung steht an der Spitze als die kommerziell ausgereifteste und am weitesten verbreitete Sequenzierungsmethodik. In diesem Bereich treten fünf verschiedene Kategorien auf: Pyrophosphat-Sequenzierung, synthetische Sequenzierung, Ligation-Sequenzierung, Halbleiter-Sequenzierung und DNB.

NGS, oder Next-Generation High-Throughput-Sequenzierung, baut auf der Grundlage der synthetischen Terminierungssequenzierung auf und beruht auf der PCR-Amplifikation von DNA-Vorlagen, die an festen Oberflächen für die Synthese und Sequenzierung gebunden sind. Diese Technologie findet umfangreiche Anwendung bei der Identifizierung von Kandidatengenen, die mit Krankheiten in Verbindung stehen, von monogenen Erkrankungen bis hin zu komplexen Bedingungen wie Diabetes, Fettleibigkeit und sogar Krebs.

Während Next-Generation-Sequenzierung verfügt über bemerkenswerte Durchsatz, Präzision und Erschwinglichkeit, jedoch stellen die kurzen Leselängen Herausforderungen dar, die potenziell zum Verlust von weniger häufigen Sequenzinformationen während der Sequenzierung führen können. Darüber hinaus kann, mit Ausnahme von DNB, die Abhängigkeit von PCR systematische Fehler einführen, was wiederholte Sequenzierungen erforderlich macht, um Abweichungen zu verringern.

Die DNB-Technologie umgeht diese Probleme, indem sie PCR-Bias minimiert und somit die Sequenziergenauigkeit verbessert. Folglich entwickelt sich das Hochdurchsatz-Sequenzieren zu einer Schlüsseltechnologie, die die weitverbreitete Einführung und Kommerzialisierung der Gen-Sequenzierung vorantreibt.

Langzeit-Sequenzierung

Einzelmolekül-Lesezeit-Sequenzierungstellt einen Paradigmenwechsel dar, indem physikalische Methoden genutzt werden, um genetische Informationen auf der Ebene einzelner Moleküle zu entschlüsseln. Diese Technologie, die sich aus der NGS entwickelt hat, behebt die grundlegenden Einschränkungen der Lesegröße und der PCR-Bias, die ihrem Vorgänger eigen sind.

Als bahnbrechender Fortschritt in der Genomsequenzierung, PacBio Einzelmolekül-Lesezeit-Sequenzierung bietet beispiellose Möglichkeiten zur Analyse von genetischem Material sowohl auf der Einzelzell- als auch auf der Einzelmolekülebene.

Die Long-Read-Sequenzierungstechnologie erweitert die Sequenzleselängen über die von ihren Vorgängern erreichten hinaus und ermöglicht die direkte Erkennung von RNA- und Methylierungssequenzen ohne die Notwendigkeit einer PCR-Amplifikation. Durch das Umgehen der PCR verringert sie das Risiko, künstliche Mutationen einzuführen.

Jedoch, während PacBio SMRT-Sequenzierung exzelliert in vielen Bereichen, hat jedoch Schwächen bei Anwendungen zur Einzelgen-Detektion, insbesondere bei monogenen Erkrankungen. Ihr Hauptnachteil liegt in der geringeren Sequenziergenauigkeit, die mehrere Wiederholungen oder Korrekturen durch probabilistische Algorithmen erfordert, um die Zuverlässigkeit zu erhöhen.

Dieser Bedarf an repetitiver Sequenzierung oder algorithmischer Korrektur erhöht die Kosten erheblich und verringert die Effizienz der Sequenzierung, was Herausforderungen für die breite Akzeptanz und Implementierung mit sich bringt.

Oxford Nanopore Technologien (ONT)hat bahnbrechende Fortschritte in der Sequenzierungstechnologie gemacht, die sowohl die Kosten- als auch die Geschwindigkeitsparameter revolutionieren und gleichzeitig die Größe der Instrumente kontinuierlich verkleinern. Zentral für die Innovation von ONT ist der Nanopore, ein winziges Loch, das auf einer widerstandsfähigen Membran fixiert ist, wobei ein motorisiertes Protein seine Bewegung über ein transmembranäres elektrisches Feld ermöglicht.

In diesem Aufbau wird ein DNA-Einzelstrang durch den Nanopore von dem motorisierten Protein hindurchgezogen, das unter dem Einfluss des transmembranären elektrischen Feldes vom negativen zum positiven Pol bewegt wird. Aufgrund der winzigen Größe des Nanopores kann nur eine einzelne Base hindurchtreten, wobei jede Base eine einzigartige Störung des elektrischen Stroms verursacht, die anschließend detektiert und aufgezeichnet wird.

Nanoporen-Sequenzierung verfügt über mehrere Vorteile, darunter verlängerte Leselängen, Kosteneffizienz, schnelle Sequenzierungsgeschwindigkeiten und bemerkenswerte Effizienz. Es ermöglicht dynamische Echtzeit-Sequenzierung und unterstützt die direkte Sequenzierung von nativer DNA und RNA, wobei Erkennungsgenauigkeiten von 92 % bis 98 % erreicht werden.

Trotz dieser Stärken bleibt das Nanoporen-Sequencing hinter der Genauigkeit zurück, die durch Next-Generation-Sequencing-Methoden erreicht wird, mit Genauigkeitsraten, die typischerweise zwischen 92 % und 98 % liegen. Im Gegensatz zum PacBio SMRT-Sequencing, das wiederholtes Sequencing zur Verbesserung der Genauigkeit einsetzt, verlässt sich das Nanoporen-Sequencing auf Hydrolyse-Sequencing-Methoden, was zu längeren Sequenzierungszeiten und eingeschränkten Möglichkeiten zur Verbesserung der Genauigkeit führt.

Daher, während Nanoporen-Sequenzierung bietet bemerkenswerte Vorteile, einschließlich seiner Vielseitigkeit und Echtzeitfähigkeiten, jedoch stellen seine geringere Sequenzierungsgenauigkeit und die begrenzten Mechanismen zur Verbesserung der Genauigkeit Herausforderungen für die Feinabstimmung von Sequenzierungsparametern wie Zeit und Kosten dar.

Referenz:

1. Initiative, Arabidopsis-Genom. "Analyse der Genomsequenz der blühenden Pflanze Arabidopsis thaliana." Natur 408.6814 (2000): 796-815.