Umfassender Leitfaden zu DNA-Methylierungsarrays in der epigenetischen Forschung

Epigenetik umfasst einen entscheidenden Rahmen, in dem vererbbare Veränderungen im Genom auftreten, ohne dass gleichzeitig Änderungen an der zugrunde liegenden DNA-Sequenz erfolgen, was zu beobachtbaren phänotypischen Variationen führt. Diese Disziplin wird weithin als ein bedeutender Zweig der Genetik angesehen. Ein verbreitetes Missverständnis besagt, dass epigenetische Modifikationen keine Vererbbarkeit aufweisen; jedoch ist gut dokumentiert, dass solche Modifikationen über Generationen hinweg übertragen werden können.

Im Bereich der Epigenetik spielt die DNA-Methylierung eine zentrale Rolle und ist ein Hauptforschungsgegenstand. DNA-Methylierung übt erheblichen Einfluss auf die Chromatinarchitektur, die DNA-Konformation, die genomische Stabilität und die Interaktionsmodalitäten zwischen DNA und assoziierten Proteinen aus. Jüngste Fortschritte bei der Aufklärung der DNA-Methylierung wurden von erheblichen Fortschritten in den Nachweismethoden begleitet, wobei die Methylierungsarray-Technologie als ein dominierendes Werkzeug in diesem Bereich hervorgetreten ist.

Dieser Artikel bemüht sich, eine umfassende und detaillierte Untersuchung der DNA-Methylierung und der Methylierungsarray-Technologien zu präsentieren, um ein erschöpfendes Verständnis dieser wesentlichen Aspekte zu vermitteln.

Was ist ein DNA-Methylierungs-Array?

DNA-Methylierungsarrays stellen Hochdurchsatz-Analyseinstrumente dar, die für die umfassende Bewertung der CpG-Stellenmethylierung im gesamten Genom entwickelt wurden. DNA-Methylierung, anerkannt als eine der intensivsten untersuchten epigenetischen Modifikationen, erleichtert die kovalente Bindung einer Methylgruppe an das 5. Kohlenstoffatom von Cytosin innerhalb von CpG-Dinukleotiden (5'-3' Orientierung), ohne die primäre DNA-Sequenz zu verändern. Dieses biochemische Ereignis führt zur Bildung von 5-Methylcytosin (5mC) und hat einen erheblichen Einfluss auf die Muster der Genexpression.

DNA-Methylierung ist integraler Bestandteil der Regulation und Reprogrammierung der Genexpression und umfasst eine Reihe kritischer physiologischer Prozesse. Zu diesen Prozessen gehören die Genstilllegung, genomische Prägung, Inaktivierung des X-Chromosoms sowie die Etablierung und Aufrechterhaltung zellspezifischer Expressionsprogramme. Es ist bemerkenswert, dass DNA-Methylierung die häufigste und verbreitetste epigenetische Modifikation bei Säugetieren ist, einschließlich Homo sapiens und Mus musculus.

Diese Arrays ermöglichen die detaillierte Untersuchung von Methylierungsmustern, die mit zahlreichen biologischen Prozessen und pathologischen Zuständen, wie Karzinogenese, Entwicklungsanomalien und Alterung, verbunden sind.

Prinzipien von DNA-Methylierungsarrays

DNA-Methylierungsarrays Nutzen Sie die Mikroarray-Technologie, um die Methylierungsniveaus an Tausenden bis Millionen von CpG-Stellen gleichzeitig zu messen. Dies wird erreicht, indem bisulfit-konvertierte DNA an Sonden auf dem Array hybridisiert wird. Der Bisulfit-Konversionsprozess deaminiert unmethylierte Cytosine zu Uracil, während methylierte Cytosine unverändert bleiben, was eine Unterscheidung zwischen methylisierten und unmethylisierten Stellen ermöglicht.

Vorteile von Methylierungsarrays

DNA-Methylierungsarrays bieten mehrere Vorteile gegenüber anderen Methoden der Methylierungsanalyse, wie z.B. der Ganzgenom-Bisulfit-Sequenzierung (WGBS) und der gezielten Bisulfit-Sequenzierung:

Hochdurchsatzanalyse: Effizientes genomweites Screening

Methylierungsarrays ermöglichen das Hochdurchsatz-Screening von DNA-Methylierung über das gesamte Genom hinweg. Diese Fähigkeit ermöglicht es Forschern, Tausende von CpG-Stellen gleichzeitig zu untersuchen und bietet einen umfassenden Überblick über die Methylierungslandschaft. Zum Beispiel zeigten Bibikova et al. (2006), dass Methylierungsarrays DNA-Methylierung in Krebsgenomen effektiv profilieren können, indem sie kritische epigenetische Veränderungen identifizieren, die mit der Tumorentstehung verbunden sind.

Präzision und Sensitivität: Genauigkeit bei der Erkennung von Methylierungsänderungen

Methylierungsarrays sind darauf ausgelegt, eine hohe Präzision und Sensitivität bei der Erkennung von Methylierungsänderungen mit einer Auflösung auf Einzelbasis zu bieten. Diese Genauigkeit ist entscheidend für die Identifizierung subtiler Methylierungsunterschiede, die erhebliche biologische Auswirkungen haben können. Eine Studie von Sandoval et al. (2011) hob die Fähigkeit von Methylierungsarrays hervor, frühe epigenetische Veränderungen bei Darmkrebs zu erkennen, was eine frühzeitige Diagnose und potenzielle Intervention erleichtert.

Kosten-Effektivität: Erschwingliches genomisches Profiling

Im Vergleich zu Whole-Genome-Bisulfit-Sequenzierung (WGBS)Methylierungsarrays bieten eine kostengünstige Alternative zur genomweiten Methylierungsanalyse. Während WGBS umfassende Abdeckung bietet, ist es oft prohibitively teuer für großangelegte Studien. Methylierungsarrays hingegen liefern erhebliche Daten zu einem Bruchteil der Kosten, was sie für breitere Anwendungen zugänglich macht. Beispielsweise betonte ein Kostenvergleich von Rakyan et al. (2011) die wirtschaftlichen Vorteile der Verwendung von Methylierungsarrays für große Kohortenstudien in Epigenetik.

Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit: Konsistente Ergebnisse über Studien hinweg

Einer der wesentlichen Vorteile von Methylierungsarrays ist ihre Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit über verschiedene Studien und Labore hinweg. Die standardisierten Protokolle und das robuste Plattformdesign tragen zu konsistenten und vergleichbaren Ergebnissen bei. Eine Meta-Analyse von Liu et al. (2014) bestätigte die Reproduzierbarkeit von Methylierungsarray-Daten und unterstützte deren Verwendung in der multizentrischen epigenetischen Forschung.

Breite Anwendbarkeit: Vielseitigkeit in Forschungsanwendungen

Methylierungsarrays sind vielseitige Werkzeuge, die in verschiedenen Forschungsanwendungen eingesetzt werden, von der Grundlagenforschung bis hin zu klinischen Diagnosen. Sie werden verwendet, um verschiedene biologische Prozesse zu untersuchen, einschließlich Entwicklung, Krankheitsverlauf und Reaktion auf Behandlungen. Zum Beispiel nutzten Hirst und Marra (2010) Methylierungsarrays, um die epigenetische Regulation der Genexpression in Stammzellen zu untersuchen und Einblicke in die Mechanismen zu gewinnen, die der zellulären Differenzierung zugrunde liegen.

Integration mit anderen Omics-Daten: Umfassende Multi-Omics-Analyse

Methylierungsarrays können mit anderen Omics-Daten, wie Transkriptomik und Proteomik, integriert werden, um einen ganzheitlichen Blick auf biologische Systeme zu bieten. Diese Integration erleichtert die Korrelation von DNA-Methylierungsmustern mit der Genexpression und der Proteinaktivität, was das Verständnis komplexer regulatorischer Netzwerke verbessert. Die Studie von Laird (2010) illustrierte die Kraft der Kombination von Methylierungsdaten mit Genexpressionsprofilen, um epigenetische Marker bei Brustkrebs aufzudecken.

Was sind Illumina-Methylierungs-Mikroarrays?

Illumina-Methylierungs-Mikroarrays sind leistungsstarke Werkzeuge für die genomweite DNA-Methylierung Profilierung. Diese Arrays nutzen die bewährten Chemien von Illumina und die hochdichte, perlenbasierte Technologie, um eine Einzel-Nukleotid-Auflösung und umfassende Abdeckung des Methyloms zu bieten.

Die Entwicklung der Illumina-Methylierungs-Mikroarrays vom 450K-Array im Jahr 2010 zum 850K-Array im Jahr 2015 und zuletzt dem 935K Array im November 2023 veröffentlicht, spiegelt erhebliche Fortschritte in der epigenetischen Forschung im Bereich der menschlichen Gesundheit und Krankheit wider. Die Analyse der DNA-Methylierung hat entscheidende Einblicke in genregulatorische Mechanismen geliefert und war maßgeblich an der Identifizierung und Validierung von Biomarkern beteiligt. Im März 2024 führte Illumina ein neuartiges Methylierungs-Array ein, das Methylierungs-Screening-Array (MSA), mit 270.000 CpG-Stellen. Dieses Array wurde mit einem Fokus auf häufige menschliche Merkmale, verbreitete Krankheitsphänotypen, Umweltbelastungen, Alterung und zellspezifische Marker entwickelt. Es richtet sich an spezialisierte Krankheitskohorten und großangelegte Gesundheits-Screenings und betont aufkommende funktionelle Genomik-Biomarker, um einen gezielten Ansatz für krankheitsspezifische Forschung und umfassende Gesundheitsuntersuchungen zu bieten.

Gestationsdiabetes mellitus Infinium Methylation EPIC Assay Workflow (Dias, S. et al., Mellitus. Int. J. Mol. Sci.. 2019)

Infinium Methylierung EPIC (850K)

Das Infinium Methylation EPIC-Array, allgemein als 850K-Methylierungs-Array bezeichnet, behält über 90 % der CpG-Stellen seines Vorgängers, des Infinium Human Methylation450-Arrays, bei. Darüber hinaus umfasst es 350.000 CpG-Stellen in Enhancer-Regionen, was die Erkennung von über 850.000 Methylierungsstellen im menschlichen Genom ermöglicht. Dieses Array bietet eine robuste Lösung zur Untersuchung epigenetischer Variationen, indem es quantitative Methylierungsbewertungen an einzelnen CpG-Stellen sowohl aus Standard- als auch aus formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Proben bereitstellt. Es ist speziell für menschliche Proben konzipiert und spiegelt seine gezielte Anwendung in der menschlichen epigenetischen Forschung wider.

Tabelle 1: Abdeckung des Infinium MethylationEPIC Arrays über Genregionen

Das 850K-Methylierungs-Array wird in epigenomweiten Assoziationsstudien (EWAS) an verschiedenen menschlichen Gewebeproben eingesetzt. Neben der Zielsetzung von CpG-Stellen umfasst dieses Array zahlreiche andere wertvolle Loci:

a. CpG-Stellen, die außerhalb von CpG-Inseln liegen; b. Nicht-CpG-Methylierungsstellen (CHH), die in menschlichen Stammzellen identifiziert wurden; c. Differenziell methylierten Loci zwischen Tumor- und Normalgeweben in verschiedenen Gewebetypen; d. FANTOM5-Enhancer; e. ENCODE offene Chromatinregionen und Enhancer; f. DNase-hypersensitive Stellen; g. miRNA-Promotorregionen; h. Über 90 % der Marker aus dem Infinium Human Methylation450-Array.

Das Infinium Mouse Methylation BeadChip-Array

Das Infinium Mouse Methylation BeadChip-Array enthält 285.000 Methylierungsnachweisstellen, die eine präzise Methylierungsbewertung auf Ebene der einzelnen CpG-Stellen ermöglichen. Dieses Array zeigt eine hohe technische Reproduzierbarkeit mit einer parallelen Reproduzierbarkeitsrate von 98 %. Es bietet eine umfassende genomische Abdeckung, einschließlich CpG-Inseln, Transkriptionsstartstellen von Genen, Genkörperregionen, Regionen repetitiver Elemente, Enhancer-Regionen und Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren.

Infinium^TM MethylationEPIC v2.0 (950K): Fortgeschrittene Methylierungsprofilierung

Das Infinium^TM MethylationEPIC v2.0 (950K) Array stellt den neuesten Fortschritt in Illuminas Reihe von DNA-Methylierungs-Mikroarrays dar. Diese verbesserte Version basiert auf der soliden Grundlage des Infinium MethylationEPIC (850K) Arrays und bietet eine erweiterte Abdeckung sowie ein verfeinertes Assay-Design, um den wachsenden Anforderungen der epigenetischen Forschung gerecht zu werden. 

MethylationEPIC v2.0 VS. MethylationEPIC v1.0 (Quelle für Illumina)

Erweiterte Abdeckung des Infinium™ MethylationEPIC v2.0 Arrays

Das Infinium™ MethylationEPIC v2.0 Array erweitert seine Abdeckung auf über 950.000 CpG-Stellen und verbessert damit erheblich den Umfang der Analyse von Methylierungsstellen im Vergleich zu seinem Vorgänger. Diese Verbesserung umfasst:

Integration aktueller epigenomischer DatenDas 950K-Array integriert kürzlich identifizierte CpG-Stellen, die aus aktuellen epigenomischen Studien stammen. Diese Integration stellt sicher, dass Forscher Zugang zu neuesten Erkenntnissen und neu identifizierten Interessensgebieten im Genom haben.

Breite genomische RepräsentationDas Array umfasst CpG-Stellen, die über Genkörper, Promotoren, Enhancer und andere regulatorische Elemente verteilt sind, wodurch eine umfassende Analyse des Methyloms ermöglicht wird. Diese umfassende Darstellung erlaubt eine umfangreiche Untersuchung der genomischen Landschaft.

Vielfältige biologische KontexteDie erweiterte Abdeckung umfasst verschiedene Gewebe und Zelltypen, wodurch die Erfassung von Methylierungsmustern ermöglicht wird, die für eine Vielzahl biologischer Prozesse und pathologischer Bedingungen relevant sind. Diese Vielfalt gewährleistet die Relevanz der Methylierungsdaten in einer Vielzahl biologischer und krankheitsbezogener Kontexte.

Verbesserte Assay-Entwicklung

Das Infinium^TM MethylationEPIC v2.0 (950K) Array nutzt eine optimierte Kombination aus Infinium I und Infinium II Assay-Chemien, die sowohl die Tiefe als auch die Sensitivität der Methylierungsdetektion verbessert.

Infinium I Assay ChemieDiese Chemie bietet eine hohe Spezifität und Sensitivität für CpG-Stellen mit dichter Methylierung und gewährleistet eine genaue Erkennung in Regionen mit hoher Methylierungsdichte.

Infinium II Assay-ChemieDiese Chemie ist für eine breitere Abdeckung ausgelegt und erfasst CpG-Stellen mit variablen Methylierungsmustern. Die Kombination dieser beiden Chemien ermöglicht ein ausgewogenes und umfassendes Methylierungsprofil.

Erhöhte ErkennungsempfindlichkeitDas verfeinerte Assay-Design verbessert die Empfindlichkeit der Detektion und ermöglicht die Identifizierung subtiler Methylierungsänderungen, die in Krankheits- und Entwicklungsstudien entscheidend sein können.

Hohe Durchsatzrate und Effizienz

Das Infinium^TM MethylationEPIC v2.0 (950K) Array ist für hohe Durchsatzraten ausgelegt, was es für großangelegte Studien geeignet macht. Zu den wichtigsten Merkmalen, die zu seiner Effizienz beitragen, gehören:

SkalierbarkeitDas Array kann eine große Anzahl von Proben gleichzeitig verarbeiten, was bevölkerungsweite Studien und Kohortenanalysen erleichtert.

Optimierter ArbeitsablaufÄhnlich wie andere Infinium-Arrays verwendet das 950K-Array ein PCR-freies Protokoll, das die Komplexität reduziert und das Risiko von Amplifikationsverzerrungen minimiert.

Automatisierungs-KompatibilitätDer Workflow des Arrays ist mit automatisierten Plattformen kompatibel, was den Durchsatz erhöht und die praktische Zeit für Forscher reduziert.

Anwendungen in der epigenetischen Forschung

Die erweiterte Abdeckung und das verbesserte Design des Infinium™ MethylationEPIC v2.0 Arrays machen es zu einem unschätzbaren Instrument für eine Vielzahl von Anwendungen im Bereich der Epigenetik:

Epigenomweite Assoziationsstudien (EWAS)Die umfassende Abdeckung des 950K-Arrays erleichtert die Identifizierung von unterschiedlich methylierten Regionen (DMRs), die mit verschiedenen Krankheiten und phänotypischen Merkmalen in unterschiedlichen Populationen assoziiert sind. Diese Fähigkeit ist entscheidend für das Vorantreiben unseres Verständnisses der epigenetischen Beiträge zu komplexen Merkmalen und Krankheitsursachen.

KrebsforschungDie Präzision des Arrays bei der Erkennung subtiler Methylierungsänderungen ist von größter Bedeutung in der onkologischen Forschung. Epigenetische Modifikationen spielen häufig eine entscheidende Rolle in den Prozessen der Tumorentstehung und Krebsprogression, weshalb die hochauflösende Methylierungsanalyse ein kritischer Bestandteil von Krebsstudien ist.

EntwicklungsbiologieForscher können die Array-Technologie nutzen, um Methylierungsmuster in verschiedenen Entwicklungsstadien zu untersuchen und dadurch die regulatorischen Mechanismen, die der Genexpression und der Etablierung zellulärer Identitäten zugrunde liegen, zu erhellen. Diese Anwendung liefert wichtige Erkenntnisse in die Entwicklungsbiologie und Differenzierungsprozesse.

Umwelt-EpigenetikDas Array ist auch anwendbar, um die Auswirkungen von Umweltfaktoren auf zu untersuchen. DNA-MethylierungDiese Forschung ist entscheidend für das Verständnis von Gen-Umwelt-Interaktionen und deren Auswirkungen auf Gesundheitsresultate und erweitert unser Wissen über epigenetische Reaktionen auf Umweltreize.

Methylierungs-Screening-Array (MSA 270K): Zielgerichtete Methylierungsanalyse

Der Methylierungs-Screening-Array (MSA 270K) by Illumina ist ein hochspezialisiertes Mikroarray, das für gezielte Methylierungsanalysen entwickelt wurde. Es bietet eine gezielte Abdeckung von CpG-Stellen, die für spezifische Forschungsbereiche relevant sind, und bietet eine kosteneffiziente und effiziente Lösung für großangelegte Methylierungsstudien. Die gezielte Abdeckung von krankheitsassoziierten CpG-Stellen und regulatorischen Elementen macht es zu einem unschätzbaren Werkzeug für die Entdeckung von Biomarkern, vergleichende Studien und longitudinale Forschung.

Gezielte Auswahl von CpG-Stellen

Das MSA 270K Array bietet eine sorgfältig zusammengestellte Auswahl von etwa 270.000 CpG-Stellen. Diese Stellen wurden strategisch ausgewählt, basierend auf ihrer Relevanz für verschiedene biologische und klinische Forschungsanwendungen.

Krankheitsassoziierte CpG-StellenDas Array umfasst CpG-Stellen, die mit wichtigen Krankheiten wie Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und neurologischen Störungen in Verbindung gebracht werden. Dieser gezielte Ansatz ermöglicht es den Forschern, sich auf Regionen mit etablierter klinischer Bedeutung zu konzentrieren.

Regulatorische ElementeDie Abdeckung erstreckt sich auf CpG-Stellen innerhalb von Promotoren, Enhancern und anderen regulatorischen Elementen. Dies stellt sicher, dass wichtige regulatorische Regionen in die Analyse einbezogen werden, was Einblicke in die epigenetische Regulation der Genexpression bietet.

Gewebespezifische MethylierungDie ausgewählten CpG-Stellen repräsentieren Methylierungsmuster, die spezifisch für verschiedene Gewebe und Zelltypen sind, und ermöglichen Studien, die eine gewebespezifische Methylierungsprofilierung erfordern.

Kosteneffiziente Lösung

Der MSA 270K Array ist darauf ausgelegt, eine kostengünstige Alternative zu umfassenderen Arrays anzubieten, während eine hochwertige Datenausgabe beibehalten wird.

Reduzierte KostenDurch die Fokussierung auf eine gezielte Auswahl von CpG-Stellen reduziert das MSA 270K-Array die Reagenzien- und Verarbeitungskosten. Dies macht es zu einer attraktiven Option für großangelegte Studien und Institutionen mit Budgetbeschränkungen.

Effiziente Nutzung von RessourcenDer zielgerichtete Ansatz des Arrays stellt sicher, dass Ressourcen effizient genutzt werden, indem er sich auf Regionen konzentriert, die am wahrscheinlichsten bedeutende Ergebnisse liefern. Dies erhöht die Gesamtkosteneffektivität der Forschung.

Hohe Durchsatzrate und Skalierbarkeit

Das MSA 270K Array unterstützt die Hochdurchsatzverarbeitung, was es für umfangreiche Bevölkerungsstudien und große Stichprobenkohorten geeignet macht.

Skalierbarer WorkflowDer Workflow des Arrays ist für Skalierbarkeit ausgelegt und ermöglicht die gleichzeitige Verarbeitung zahlreicher Proben. Dies ist besonders vorteilhaft für Studien, die große Populationen oder mehrere Zeitpunkte umfassen.

Automatisierungs-KompatibilitätÄhnlich wie andere Illumina-Arrays ist das MSA 270K mit automatisierten Laborplattformen kompatibel. Dies reduziert die manuelle Arbeit und erhöht den Durchsatz, sodass große Datensätze effizient generiert werden können.

Anwendungen in der epigenetischen Forschung

Die gezielte Natur des MSA 270K Array macht es zu einem wertvollen Werkzeug für eine Vielzahl von epigenetischen Forschungsanwendungen.

Biomarker-EntdeckungDer Fokus des Arrays auf krankheitsassoziierten CpG-Stellen erleichtert die Entdeckung von Methylierungs-Biomarkern für die frühe Diagnose, Prognose und Überwachung der therapeutischen Ansprechens.

Vergleichende StudienForscher können das MSA 270K-Array verwenden, um Methylierungsmuster unter verschiedenen Bedingungen zu vergleichen, wie zum Beispiel gesunden vs. erkrankten Geweben, und so Einblicke in Krankheitsmechanismen und potenzielle therapeutische Ziele zu gewinnen.

LängsschnittstudienDie Kosten-Effektivität und die hohe Durchsatzfähigkeit des Arrays machen es ideal für longitudinale Studien, die Methylierungsänderungen über die Zeit verfolgen, und bieten Einblicke in dynamische epigenetische Modifikationen.

Datenqualität und Reproduzierbarkeit

Trotz seines gezielten Fokus hält das MSA 270K-Array hohe Standards in Bezug auf Datenqualität und Reproduzierbarkeit ein.

Robustes Assay-Design: Das Array verwendet die bewährten Assay-Chemien von Illumina, die eine zuverlässige und genaue Methylierungsdetektion gewährleisten.

Reproduzierbare Ergebnisse: Umfassende Validierungs- und Qualitätskontrollmaßnahmen stellen sicher, dass die von dem MSA 270K-Array generierten Daten hochgradig reproduzierbar sind, was Vertrauen in die Forschungsergebnisse schafft.

Vergleich verschiedener Illumina-Methylierungs-Mikroarray-Formate

Wie man Illumina-Methylierungs-Mikroarrays auswählt

Die Auswahl des geeigneten Illumina-Methylierungs-Mikroarrays hängt von den spezifischen Anforderungen Ihrer Forschung und der gewünschten Auflösung der Methylierungsanalyse ab. Hier sind die wichtigsten Überlegungen zur Auswahl zwischen dem Infinium MethylationEPIC (850K), Infinium MethylationEPIC v2.0 (950K), und Methylierungsscreening-Array (MSA 270K):

1. Forschungsziele

Breite Methylierungsstudien: Für umfassende genomweite Studien und die Entdeckung von Biomarkern eignet sich das Infinium MethylationEPIC (850K) Array aufgrund seiner umfangreichen Abdeckung von über 850.000 CpG-Stellen.

Detaillierte Methylierungsprofilierung: Wenn Ihre Studie eine höhere Auflösung und umfassendere Abdeckung erfordert, ist das Infinium MethylationEPIC v2.0 (950K) Array mit über 950.000 CpG-Stellen die beste Wahl. Es umfasst zusätzliche CpG-Stellen für eine detailliertere Analyse.

Erstscreening: Für gezielte Methylierungsstudien oder Erstscreenings, bei denen Kosten-Effektivität im Vordergrund steht, ist das Methylierungs-Screening-Array (MSA 270K) mit über 270.000 CpG-Stellen geeignet. Es bietet eine gezielte Abdeckung, die für spezifische Zielstudien geeignet ist.

2. Abdeckung und Auflösung

Umfassende genomweite Abdeckung: Wählen Sie die Infinium MethylationEPIC (850K) oder die Infinium MethylationEPIC v2.0 (950K) Arrays für Studien, die eine breite Abdeckung des Genoms erfordern. Letzteres bietet eine noch umfangreichere und detailliertere Abdeckung.

Fokussierte Abdeckung: Der MSA 270K ist für eine fokussierte Abdeckung konzipiert, was ihn ideal für Studien macht, die einen kosteneffizienten Ansatz mit ausreichender Auflösung für spezifische Ziele erfordern.

3. Kompatibilität der Probenarten

Alle drei Arrays (850K, 950K und 270K) sind mit verschiedenen Probenarten kompatibel, einschließlich FFPE- und frisch gefrorenen Geweben. Diese Flexibilität stellt sicher, dass Sie eines dieser Arrays basierend auf anderen Faktoren auswählen können, ohne sich um die Probenkompatibilität sorgen zu müssen.

4. Reproduzierbarkeit und analytische Sensitivität

Hohe Reproduzierbarkeit: Alle Arrays zeigen eine hohe Reproduzierbarkeit (>98% für technische Replikate), was zuverlässige Ergebnisse über verschiedene Experimente hinweg gewährleistet.

Analytische Sensitivität: Jedes Array weist eine hohe analytische Sensitivität auf, mit einem Delta-Beta-Wert von 0,2 und einer falsch-positiven Rate von weniger als 1 %. Diese Konsistenz über die Arrays hinweg bedeutet, dass Sie basierend auf Abdeckung und Auflösung auswählen können, ohne die Sensitivität zu beeinträchtigen.

5. Software und Analysetools

Alle Arrays werden vom GenomeStudio Methylation Module unterstützt, was eine integrierte Analyse ermöglicht. Dies stellt sicher, dass die Datenanalyse und -interpretation optimiert sind, unabhängig vom gewählten Array.

6. Kosten-Effektivität

Budgetbeschränkungen: Für großangelegte Screening-Projekte, bei denen das Budget eine wesentliche Rolle spielt, bietet der MSA 270K eine kosteneffiziente Lösung, ohne die analytische Leistung zu beeinträchtigen.

Detaillierte Analyseanforderungen: Für Projekte, bei denen eine detaillierte Methylierungsprofilierung entscheidend ist, kann die Investition in das Infinium MethylationEPIC v2.0 (950K) den größten Wert bieten, aufgrund seiner umfassenden Abdeckung.

7. Typische Anwendungsfälle

Infinium MethylationEPIC (850K): Geeignet für umfassende Methylierungsstudien und die Entdeckung von Biomarkern, bietet umfassende Abdeckung und Hochdurchsatzfähigkeiten.

Infinium MethylationEPIC v2.0 (950K): Ideal für detaillierte Methylierungsprofilierung und umfassende Analyse mit höherer Auflösung.

Methylierungs-Screening-Array (MSA 270K): Am besten für die initiale Methylierungs-Screening und spezifische Zielstudien geeignet, bietet ein ausgewogenes Verhältnis zwischen Kosten und Abdeckung.

Durch die Bewertung dieser Faktoren können Forscher das am besten geeignete Illumina-Methylierungs-Mikroarray auswählen, das mit ihren spezifischen Forschungszielen, ihrem Budget und der gewünschten Auflösung übereinstimmt. CD Genomics bietet alle drei Optionen an und bietet Flexibilität und Unterstützung, um unterschiedlichen Forschungsbedürfnissen gerecht zu werden.

Merkmale von Illumina Methylierungsmikroarrays

Umfangreiche CpG-AbdeckungDas 450K-Array deckt über 450.000 CpG-Stellen ab, während das EPIC-Array diese Abdeckung auf über 850.000 Stellen erweitert und damit einen Großteil der bekannten regulatorischen Regionen umfasst.

Hohe Sensitivität und SpezifitätDie Infinium-Technologie gewährleistet eine hohe Sensitivität zur Erkennung von Methylierungsänderungen, selbst auf niedrigen Ebenen, und eine hohe Spezifität zur genauen Unterscheidung zwischen methylieren und unmethylieren Cytosinen.

Flexibles Beispiel-EingabeDiese Arrays sind mit verschiedenen Probenarten kompatibel, einschließlich Niedriginput- und degradiertem DNA aus FFPE-Geweben, was sie vielseitig für unterschiedliche Forschungs- und klinische Szenarien macht.

Umfassende AnmerkungenDie Arrays kommen mit detaillierten Annotationen, einschließlich genzentrierter Informationen, CpG-Inseln und regulatorischen Regionen, die bei der Interpretation von Methylierungsdaten im biologischen Kontext helfen.

Unterstützung für fortgeschrittene Bioinformatik: Illumina bietet umfassende bioinformatische Unterstützung mit Werkzeugen und Pipelines für die Datenverarbeitung, Normalisierung und Analyse, die die Gewinnung bedeutungsvoller Erkenntnisse aus den Methylierungsdaten erleichtern.

Methylierungs-Array-Workflow

Probenvorbereitung

DNA-Extraktion

Der Workflow für die DNA-Methylierungsanalyse beginnt mit der Extraktion von DNA aus frischen und konservierten Gewebeproben. Für frisch gefrorene Gewebe werden Standardmethoden zur DNA-Extraktion eingesetzt, um hochwertige DNA sicherzustellen. Konservierte Gewebe, wie solche, die in Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet sind (FFPE), erfordern spezialisierte Extraktionstechniken, um DNA zurückzugewinnen, die möglicherweise fragmentiert und chemisch modifiziert ist. Diese Methoden sind darauf ausgelegt, DNA zu liefern, die für die Hochdurchsatzanalyse geeignet ist und die Integrität und Qualität gewährleistet, die für eine genaue Methylierungsprofilierung erforderlich sind.

DNA-Quantifizierung und Qualitätsbewertung

Nach der Extraktion werden die DNA-Konzentration und -Reinheit mithilfe spektrophotometrischer Techniken und fluorometrischer Tests gemessen. Eine genaue Quantifizierung ist entscheidend für die nachfolgenden Schritte, während Reinheitsbewertungen helfen, minimale Kontamination sicherzustellen. Die Integrität der DNA wird häufig durch Gel-Elektrophorese überprüft, die eine visuelle Bestätigung der DNA-Größe und -Qualität liefert. Diese Qualitätskontrollmaßnahmen sind unerlässlich, um sicherzustellen, dass die DNA für die Methylierungs-Array-Analyse geeignet ist.

Bisulfit-Konversion

Konvertierungsprozess

Die Bisulfit-Konversion von DNA ist ein entscheidender Schritt in der Methylierungsanalyse. Diese chemische Behandlung wandelt unmethylierte Cytosine in Uracil um, während methylierte Cytosine unverändert bleiben. Der Prozess ist unerlässlich, um zwischen methylieren und unmethylieren Cytosinen zu unterscheiden, was eine genaue Erkennung von DNA-Methylierungsmustern ermöglicht. Eine effektive Bisulfit-Konversion ist entscheidend für die Gewinnung zuverlässiger Daten aus Methylierungsarrays, da unvollständige Konversion zu ungenauen Ergebnissen führen kann.

DNA-Restaurierung und Hybridisierung

Wiederherstellung von bisulfit-konvertierter DNA

Für Proben, die aus konservierten Geweben entnommen wurden, können zusätzliche Schritte erforderlich sein, um die bisulfit-konvertierte DNA wiederherzustellen. Dies umfasst häufig chemische Behandlungen, um die DNA zu denaturieren und zu reinigen, wodurch ihre Qualität für die Hybridisierung verbessert wird. Diese Wiederherstellungsverfahren erhöhen die Qualität der bisulfit-behandelten DNA und machen sie geeigneter für nachfolgende Analysen.

Hybridisierung zum Array

Der Hybridisierungsprozess umfasst die Anwendung der bisulfit-konvertierten DNA auf ein Mikroarray, das Sonden enthält, die spezifisch für CpG-Stellen sind. Während der Hybridisierung bindet die DNA an diese Sonden, und der Methylierungsstatus wird basierend auf dem Bindungsmuster erkannt. Dieser Schritt ist entscheidend für die Generierung der Daten, die benötigt werden, um die DNA-Methylierung im gesamten Genom zu bewerten.

Einzelbasenverlängerung und -erkennung

Erweiterung und Detektion

Nach der Hybridisierung wird die Einzelbasenerweiterung verwendet, um markierte Nukleotide, die komplementär zu den Zielsequenzen sind, einzufügen. Dieser Schritt erhöht die Sensitivität des Tests und ermöglicht eine präzise Messung der Methylierungsgrade an einzelnen CpG-Stellen. Die Intensität des Fluoreszenzsignals korreliert mit dem Grad der Methylierung und liefert quantitative Daten zu DNA-Methylierungsmustern.

Datenanalyse

Normalisierung und Qualitätskontrolle

Die Rohdaten des Methylierungsarrays werden zunächst normalisiert, um technische Variabilität und Hintergrundrauschen zu berücksichtigen. Verschiedene Qualitätskontrollmaßnahmen werden umgesetzt, wie zum Beispiel der Ausschluss von Sonden mit hohen Nachweis-p-Werten oder solchen auf Geschlechtschromosomen. Diese Schritte stellen sicher, dass die Daten zuverlässig und genau für die nachgelagerte Analyse sind.

Computational Analyse

Fortgeschrittene rechnergestützte Werkzeuge werden verwendet, um die Methylierungsdaten zu analysieren, einschließlich der Hauptkomponentenanalyse (PCA) und Clusterverfahren. Diese Analysen helfen, Muster und Assoziationen innerhalb der Daten zu identifizieren und bieten Einblicke in die biologischen Implikationen von Veränderungen der DNA-Methylierung.

Methylierungs-Array-Datenverarbeitung und Analyse-Pipeline. (C.S. Wilhelm-Benartzi et al.) Britisches Journal für Krebs 2013)

Anwendungen von Illumina-Methylierungs-Mikroarrays

Illumina-Methylierungs-Mikroarray sind leistungsstarke Werkzeuge zur Untersuchung der epigenetischen Landschaft im gesamten Genom. Diese Arrays werden in verschiedenen Bereichen der biomedizinischen Forschung aufgrund ihrer hohen Auflösung, Kosteneffizienz und der Fähigkeit, Methylierungsniveaus an Hunderttausenden von CpG-Stellen zu messen, weit verbreitet eingesetzt. Die Anwendungen von Illumina-Methylierungs-Mikroarrays reichen von der Krebsforschung über die Entwicklungsbiologie bis hin zur Neurowissenschaft und Umwelt. Epigenetikund personalisierte Medizin.

Krebsforschung

Illumina-Methylierungs-Mikroarrays haben die Krebsforschung erheblich vorangetrieben, indem sie die Identifizierung tumorspezifischer Methylierungsmuster ermöglichten. Abnormale DNA-Methylierung ist ein Kennzeichen von Krebs und betrifft oft die Hypermethylierung von Tumorsuppressorgenen und die Hypomethylierung von Onkogenen. Zum Beispiel verwendete eine Studie von Sandoval et al. (2011) die Illumina HumanMethylation27 und HumanMethylation450 BeadChips, um die Methylierung in Proben von chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) zu profilieren und dabei verschiedene Methylierungssignaturen zu identifizieren, die mit Krankheitsuntertypen und Prognose assoziiert sind. Eine weitere Studie von Aryee et al. (2013) nutzte das HumanMethylation450-Array, um die Methylierungslandschaft von kolorektalem Krebs zu kartieren und dabei wichtige epigenetische Veränderungen zu offenbaren, die die Tumorentstehung antreiben.

Entwicklungsbiologie

Methylierungs-Mikroarrays sind entscheidend für das Studium der dynamischen Veränderungen in der DNA-Methylierung während der Entwicklung. Diese Veränderungen sind entscheidend für die ordnungsgemäße Genregulation und Gewebedifferenzierung. Laurent et al. (2010) verwendeten das Illumina HumanMethylation27 BeadChip, um die Methylierungsmuster in menschlichen embryonalen Stammzellen (hESCs) und deren differenzierten Nachkommen zu untersuchen und entdeckten stadien-spezifische Methylierungsänderungen, die Pluripotenz und Differenzierung regulieren. Ähnlich verwendeten Lee et al. (2015) das HumanMethylation450-Array, um die Methylierungsdynamik während der frühen embryonalen Entwicklung zu untersuchen und Einblicke in die epigenetischen Umprogrammierungsereignisse zu geben, die nach der Befruchtung auftreten.

Neurowissenschaften

In der Neurowissenschaft erleichtern Illumina-Methylierungs-Mikroarrays das Studium der epigenetischen Mechanismen, die neurologischen Störungen zugrunde liegen. Zum Beispiel nutzten Lunnon et al. (2014) das HumanMethylation450-Array, um unterschiedliche Methylierungsmuster in Gehirnen von Alzheimer-Patienten (AD) zu identifizieren, wobei Gene, die an der Immunantwort und der neuronalen Funktion beteiligt sind, als potenzielle Mitwirkende zur AD-Pathologie hervorgehoben wurden. Eine weitere Studie von Numata et al. (2012) verwendete dasselbe Array, um Methylierungsänderungen bei Schizophrenie zu untersuchen und zahlreiche unterschiedlich methylierten Regionen (DMRs) zu identifizieren, die mit der Störung assoziiert sind.

Umwelt-Epigenetik

Umweltfaktoren, einschließlich der Nahrungsaufnahme, der Exposition gegenüber Toxinen und psychologischem Stress, haben die Fähigkeit, DNA-Methylierungsmuster zu modulieren. Diese Modifikationen haben bedeutende Auswirkungen auf Gesundheitsresultate und Krankheitsanfälligkeit. Illumina-Methylierungs-Mikroarrays dienen als wichtige Werkzeuge zur Bewertung solcher epigenetischen Veränderungen. Ein anschauliches Beispiel liefert eine EWAS, die von Breitling et al. (2011) durchgeführt wurde, bei der das HumanMethylation450-Array verwendet wurde, um den Einfluss des Rauchens auf die DNA-Methylierung zu untersuchen. Diese Studie identifizierte mehrere CpG-Stellen, an denen der Methylierungsstatus mit dem Rauchverhalten korrelierte. In ähnlicher Weise verwendeten Rusiecki et al. (2010) das HumanMethylation27 BeadChip zur Bewertung der Auswirkungen von Arsenexposition auf Methylierungsmuster, was zur Identifizierung potenzieller Biomarker führte, die auf arsenbedingte Pathologien hinweisen.

Personalisierte Medizin

Die Integration von Methylierungsdatensätzen mit anderen Omics-Daten birgt erhebliches Potenzial für den Fortschritt der personalisierten Medizin. Die Profilierung individueller Methylierungsmuster ermöglicht die Entwicklung maßgeschneiderter therapeutischer Strategien. So hat beispielsweise eine Studie des The Cancer Genome Atlas (TCGA) Konsortiums Illumina-Methylierungsarrays eingesetzt, um Patienten mit Glioblastoma multiforme (GBM) in Untergruppen zu kategorisieren, die durch unterschiedliche epigenetische und genetische Profile gekennzeichnet sind, wodurch personalisierte Behandlungsansätze erleichtert werden. Darüber hinaus können Methylierungsbiomarker, die durch diese Arrays identifiziert wurden, wertvolle Werkzeuge zur frühzeitigen Krankheitsdetektion, Prognose und Überwachung von Behandlungsreaktionen darstellen.

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