Hintergrund der Langzeit-Sequenzierung
Genetische Sequenzierungstechnologie, auch bekannt als DNA-Sequenzierung, ist eine Methode, die sich der Bewertung der Basenfolgenanordnung innerhalb der gezielten DNA-Fragmente widmet. Seit der Sanger-Sequenzierung wurden bedeutende Fortschritte in den Technologien der Next-Generation-Sequenzierung erzielt, die eine höhere Sequenzierungseffizienz sowie genauere Datenoutputs bieten. Je nach Leselänge der sequenzierten Fragmente können Sequenzierungstechnologien in Kurzlesesequenzierung und Langzeit-SequenzierungIm Vergleich zur Kurzlesesequenzierung kann die Langlesesequenzierung direkt Sequenzen > 10 kb aus nativer DNA erzeugen und kann sich zuverlässig mit Wiederholungssequenzen und großen genomischen Umstellungen befassen, um eine präzisere und vollständigere Erkennung von Nukleinsäuremolekülen zu ermöglichen, strukturelle Varianten und mehr Transkripte im Genom zu identifizieren. Jetzt werden Langlesesequenzierungsansätze durch Pacific Biosciences und Oxford Nanopore Technologien, und aufgrund seiner hohen Durchsatzrate, langen Reads und der Fähigkeit, Basismethylierungsmodifikationen direkt zu erkennen, wird es zunehmend in den Bereichen Genomassemblierung, epigenetische Marker, Transkriptomik und Metagenomik angewendet.
Überblick über Long-Read-Sequenzierung
Was sind die Methoden der Langzeit-Sequenzierung?
Langzeit-Sequenzierung(LRS), auch bekannt als Sequenzierung der dritten Generation, erfordert keine DNA-Fragmente für die Sequenzierung, wodurch gesamte repetitive Sequenzen erfasst und eine kontinuierliche und vollständige Assemblierung erreicht wird. Mit der Verbesserung des Sequenzdurchsatzes und der Genauigkeit kann die LRS-Technologie kontinuierliche Sequenzen von Zehntausenden bis zu mehreren Megabasen bestimmen, und die technologische Reife nimmt stetig zu.
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Die Hauptmethoden für Langzeit-Sequenzierung sind derzeit:
Nanoporen-SequenzierungPioniert von Oxford Nanopore Technologies (ONT) beinhaltet die Nanoporen-Sequenzierung das Durchleiten von einzelsträngigen DNA-Molekülen durch eine Protein-Nanopore, die in einer synthetischen Membran eingebettet ist. Während die DNA die Nanopore durchquert, moduliert sie den ionischen Strom, was eine Echtzeit-Erkennung von Nukleotidsequenzen ermöglicht. Die Nanoporen-Sequenzierung bietet Portabilität, schnelle Bearbeitungszeiten und die Fähigkeit, ultra-lange Reads zu erzeugen, was sie für eine Vielzahl von Anwendungen geeignet macht, einschließlich klinischer Diagnostik, Überwachung von Infektionskrankheiten und Metagenomik-Studien.
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Ein schematisches Diagramm des Mechanismus der Sequenzierung durch Oxford Nanopore Technologies (ONT) (Abbildung erstellt mit BioRender.com)
Einzelmolekül-Echtzeit (SMRT) SequenzierungEntwickelt von Pacific Biosciences (PacBio) nutzt das SMRT-Sequenzieren einen einzigartigen Ansatz des Sequenzierens durch Synthese. Es beinhaltet die Immobilisierung einzelner DNA-Polymerasemoleküle auf einer festen Oberfläche innerhalb von Zero-Mode-Wellenleiter (ZMW)-Nanostrukturen. Jeder ZMW enthält ein winziges Becken, in dem die Sequenzierung stattfindet. Während der Sequenzierung werden fluoreszenzmarkierte Nukleotide zum an die Polymerase gebundenen DNA-Template hinzugefügt, und die emittierten Lichtsignale werden in Echtzeit detektiert. Diese Methode erzeugt lange Reads mit hoher Genauigkeit und ist besonders nützlich zur Auflösung komplexer genomischer Regionen, wie z.B. repetitiver Sequenzen und struktureller Variationen.
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Prinzip der Einzelmolekül-Echtzeit (SMRT) Sequenzierung von PacBio (Goodwin, McPherson und McCombie, 2016)
Langzeit-Sequenzierung vs. Kurzzeit-Sequenzierung
Wie funktionieren sie?
Langzeit-Sequenzierung und die Kurzlese-Sequenzierung haben unterschiedliche Arbeitsprinzipien, die auf der Länge der DNA-Fragmente basieren.
Die Long-Read-Sequenzierung funktioniert in folgenden Schritten: Zunächst werden die DNA-Fragmente in größere Fragmente zerlegt, die von Tausenden bis zu Zehntausenden von Basenpaaren lang sind, und Sequenzierungsadapter werden an die Enden der DNA-Fragmente angeheftet. Die vorbereitete DNA-Bibliothek wird auf die Long-Read-Sequenzierungsplattform geladen. In SMRT-SequenzierungDNA-Polymerasemoleküle sind auf einer festen Oberfläche innerhalb einer Zero-Mode-Waveguide (ZMW) Nanostruktur immobilisiert, wodurch einzelne DNA-Moleküle an die DNA-Polymerase innerhalb der ZMW binden können. Fluoreszenzmarkierte Nukleotide werden dann der DNA-Vorlage hinzugefügt, und das emittierte Lichtsignal wird in Echtzeit detektiert. Die fluoreszierenden Signale werden durch Beobachtung ihrer zeitlichen Abfolge und Intensität in Nukleotidsequenzen umgewandelt. In Nanoporen-SequenzierungDNA-Moleküle sind in winzigen Protein-Nanoporen in einer synthetischen Membran eingebettet. Wenn DNA durch die Nanopore hindurchgeht, verursacht sie charakteristische Störungen in den ionischen Strömen, die durch die Pore fließen. Diese Störungen werden erkannt und als elektrische Signale aufgezeichnet, die dann mit speziellen Algorithmen in Nukleotidsequenzen umgewandelt werden. Diese Sequenzen werden dann an ein Referenzgenom angeglichen oder einer de novo Assemblierung unterzogen, um genetische Varianten, strukturelle Umstellungen und andere genomische Merkmale zu identifizieren.
Der Schritt-für-Schritt-Arbeitsablauf für die Kurzlese-Sequenzierung ist wie folgt: Zuerst werden die Ziel-DNA-Fragmente in kleinere Fragmente zerlegt, und dann werden Sequenzierungsadapter an die Enden der DNA-Fragmente angeheftet. Die bearbeiteten DNA-Fragmente werden über Verbindungsstücke an festen Oberflächen wie Glasplatten oder Flusszellen befestigt. Die DNA-Fragmente werden durch Brückenamplifikation oder Cluster-Generierung in identische Cluster amplifiziert. Jedes Cluster repräsentiert ein DNA-Fragment aus der ursprünglichen Probe, und die DNA-Sequenzen in jedem Cluster werden dann gleichzeitig mit einer Sequenzierungsplattform gelesen. Die Illumina-Sequenzierung ist eine der am häufigsten verwendeten Kurzlese-Sequenzierungsplattformen, die einen reversiblen Terminatoransatz nutzt. Fluoreszenzmarkierte Nukleotide werden zu Clustern von DNA-Fragmenten hinzugefügt. Während jedes Nukleotid in den wachsenden DNA-Strang eingebaut wird, wird seine fluoreszierende Markierung abgebildet und aufgezeichnet, die fluoreszierende Markierung wird nach der Aufzeichnung entfernt, und das nächste Nukleotid wird hinzugefügt. Es werden mehrere Zyklen durchgeführt, um DNA-Sequenzlesungen zu erzeugen. Die fluoreszierenden Signale oder Nukleotidsequenzen werden dann verarbeitet und in ein digitales Format umgewandelt. Die kurzen Sequenzlesungen werden dann mit einem Referenzgenom verglichen oder neu zusammengesetzt.
Was sind die Vor- und Nachteile von Langzeit-Sequenzierung und Kurzzeit-Sequenzierung?
<ul class="ullist">
<li>hohe Genauigkeit mit guter Abdeckungstiefe</li>
<li>lange Reads, die helfen können, Mehrdeutigkeiten zu klären</li>
<li>keine DNA-Amplifikation erforderlich</li>
<li>vergleichsweise schnellere Bearbeitungszeit</li>
<li>lange Laufzeit mit Phasierungsproblemen</li>
<li>die Sequenzierungsgeräte sind teuer</li>
<li>kostenintensiv für kleinere klinische Labore</li>
<li>historisch höhere Fehlerquote</li>
</ul>
<p>Vorteile der Short-Read-Sequenzierung</p>
<p>Vorteile der Long-Read-Sequenzierung</p>
<p>Nachteile der Short-Read-Sequenzierung</p>
<p>Nachteile der Long-Read-Sequenzierung</p>
Der Vorteil der Langzeit-Sequenzierung von CD Genomics
Lange Texte und hohe Genauigkeit
Die proprietäre Sequenzierungstechnologie des cd-genomes bietet eine äußerst hohe Genauigkeit und Auflösung, um komplexe genomische Varianten präzise zu erkennen.
Vielseitigkeit und Anpassungsfähigkeit
Die Long-Read-Sequenzierungsplattform von cd-genomic hat ein breites Anwendungsspektrum und eignet sich für verschiedene Anwendungen von der Grundlagenforschung bis zur klinischen Diagnose. Dazu gehören epigenetische Marker, Transkriptomik, Metagenomik usw.
Optimierter Arbeitsablauf und Skalierbarkeit
Der Long-Read-Sequenzierungs-Workflow von cd-genomic ist darauf ausgelegt, die Effizienz und Skalierbarkeit zu verbessern, Echtzeit-Datenerfassung zu ermöglichen und schnellere Durchlaufzeiten zu bieten.
Der Workflow der Langzeit-Sequenzierung von CD Genomics
Probenvorbereitung
- DNA-Extraktion: Hochwertige DNA-Proben aus dem Zielorganismus oder Gewebe extrahieren.
-
Bibliotheksvorbereitung: Verwenden Sie die proprietären Protokolle von cd-genomic, um DNA in größere Fragmente zu fragmentieren, die in der Größe von Tausenden bis Zehntausenden von Basenpaaren variieren, und um geeignete Adapter auszuwählen.
Sequenzierung
- Laden: Bereitete Sequenzierungsbibliotheken auf die cd-genomische Langzeit-Sequenzierungsplattform laden.
- Sequenzierung: Die Langzeitsequenzen wurden in Echtzeit mit der fortschrittlichen Sequenzierungstechnologie von cd-genomic erzeugt.
Datenanalyse
- Basisanalyse: Wandelt rohe elektrische oder fluoreszierende Signale, die während der Sequenzierung erzeugt werden, in Nukleotidsequenzen um.
- Lesenausgleich: Zuordnung sequenzierter langer Nukleotidsequenzen zu einem Referenzgenom oder einer de novo-Assemblierung, Identifizierung genetischer Varianten und struktureller Umstellungen.
- Variantanalyse: erkennt und analysiert genetische Varianten, einschließlich einzelner Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), Insertionen, Deletionen und struktureller Varianten.
- Annotation: Annotation der erkannten Varianten.
Fazit
Langzeit-Sequenzierung hilft dabei, Genome und Transkriptome-Karten zu erstellen, die die DNA-Detektion, die Erkennung großer struktureller Variationen und die Methylierungsdetektion ermöglichen und eine unverzichtbare Rolle in der genomischen Forschung spielen. Der Einsatz mehrerer Sequenzierungsplattformen für eine umfassende Analyse der Ziele ist derzeit die Hauptsequenzierungsmethode und hat gute Ergebnisse erzielt. Die Verbesserung der Genauigkeit der Langsequenzierung bleibt jedoch weiterhin unser Fokus. Mit der kontinuierlichen Verbesserung der Genauigkeit der Langlese-Sequenzierungstechnologie wird ihre Rolle in der wissenschaftlichen Forschung zunehmend wichtiger werden.
Mit fortschrittlicher Langzeit-Sequenzierungstechnologie und professionellen Dienstleistungen engagiert sich CD Genomics für die Unterstützung der Genomforschung. Begrüßen Sie die Zukunft der Genomik mit CD Genomics und begeben Sie sich auf eine Reise der Entdeckung und Innovation.
Referenz:
- Hu, T., N. Chitnis, D. Monos und A. Dinh (2021). "Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation: Ein Überblick." Hum Immunol 82(11): 801-811.
Richtlinien zur Einreichung von Proben
