Übersicht über cfDNA Reduzierte Repräsentations-Bisulfid-Sequenzierung (cfDNA-RRBS)

Methylierung in zirkulierendem freiem DNA (cfDNA)

Forschungen im Bereich der Epigenetik haben gezeigt, dass Methylierungsmodifikationen häufig in Säugetiergenomen vorkommen, hauptsächlich in Form von 5mCDiese Modifikation entsteht, wenn das Kohlenstoffatom an Position 5 der Cytosin-C mit einer Methylgruppe (CH3) unter dem Einfluss eines Methyltransferase-Enzyms kombiniert. Solche Methylierungsmodifikationen haben ihren Einfluss auf die Genexpression nachgewiesen und üben somit eine regulatorische Kontrolle über das Schicksal der Zelle aus, was wiederum den Beginn von Krankheiten beeinflusst.

Während der frühen Phasen der Krankheitsentwicklung, zirkulierende freie DNA (cfDNA) kann entweder durch autonome Zelllyse oder die passive Lyse von erkrankten Zellen, die vom Immunsystem erkannt werden, freigesetzt werden. Die freigesetzte cfDNA kapselt bis zu einem gewissen Grad die epigenetischen Informationen bezüglich des Ursprungs der Krankheit ein. Die rechtzeitige Erkennung der epigenetischen Hinweise, die von cfDNA getragen werden, ist von größter Bedeutung für das frühe Screening von Krankheiten.

In diesem Kontext stellt das Mining von methylierten epigenetischen Informationen einen entscheidenden Bestandteil der Forschung zu cfDNA dar. Die Fähigkeit, die in cfDNA eingebetteten epigenetischen Informationen zu erkennen und zu verstehen, könnte entscheidend sein, um frühzeitige Methoden zur Krankheitsdiagnose voranzubringen.

Bisulfit-basierte Methylierungsequenzierung

Die biologische Bedeutung der DNA-Methylierung wurde umfassend durch die Analyse von genomweiten oder vereinfachten Genom-Methylierungssequenzierungen untersucht. Diese Methoden stoßen jedoch an Grenzen, wenn es darum geht, die zahlreichen nicht-kodierenden regulatorischen Elemente im Säugetiergenom effektiv zu studieren. Während die Whole Genome Bisulfite Sequencing (WGBS) eine umfassende Abdeckung bietet, ist sie sowohl teuer als auch relativ ineffizient. Andererseits, Reduzierte Repräsentation Bisulfite-Sequenzierung (RRBS) zielt auf CpG-reiche Regionen ab, bietet jedoch keine Abdeckung von Enhancer-Subregionen und CTCF-Bindungsstellen außerhalb von CpG-Inseln.

Um diese Einschränkungen zu beheben, haben Forscher einen neuartigen Methylierungssequenzierungsansatz eingeführt, der als cfDNA-reduced representation bisulfite sequencing (cfDNA-RRBS) bekannt ist. Diese Methode verbessert die Abdeckung von Promotoren, Enhancern und CTCF-Bindungsstellen und bietet verbesserte Einblicke in die regulatorische Landschaft. Bemerkenswerterweise zeigt cfDNA-RRBS eine Kompatibilität mit geringen Probenmengen und ist für die Einzelzellanalyse anwendbar.

Vorteile von cfDNA-RRBS

• Das cfDNA-RRBS umfasst ein breiteres Spektrum an genregulatorischen Elementen und bietet eine höhere Effizienz sowie reduzierte Anforderungen an die Sequenzierungstiefe.
• Es ist geschickt darin, DNA-Methylierungsvariationen über verschiedene Zelltypen hinweg zu erkennen.
• Erleichterung der Vorhersage des Status funktioneller Elemente, cfDNA-RRBS verbessert unser Verständnis der regulatorischen Dynamik.
• Seine Anwendbarkeit erstreckt sich auf Einzelzell-DNA-Methylierungsstudien und erweitert somit den Umfang der investigativen Möglichkeiten.

Der Workflow von cfDNA-RRBS

• DNA-Extraktion und -Nachweis

Die DNA-Extraktion aus Geweben oder Zellen wurde von einer strengen Qualitätskontrolle begleitet, die die Agarose-Gelelektrophorese zur Bewertung der Integrität der DNA-Proben und zur Erkennung von Abbau umfasste. Die Gesamtmenge an DNA wurde mit einem Qubit-Fluorometer quantifiziert.

• Bibliothekskonstruktion und Qualitätsbewertung

(1) Bibliothekskonstruktion

Nach erfolgreichen Qualitätskontrollen wurden 5-10 ng genomische DNA mit dem Enzym Msp I bei 37°C für 3 Stunden verdaut. Die resultierende gereinigte DNA wurde mit T4 DNA-Ligase ligiert, um 5'-Methylcytosin-synthetische Verbindungen zu bilden. Die anschließende Bisulfitbehandlung verwandelte unmethylierte Cs in Us. Die endgültige Bibliothek wurde nach der Amplifikation über zufällige Hexamer-Primer und PCR erhalten.

(2) Qualitätskontrolle der Bibliothek

Nach dem Bau der Bibliothek wurde eine vorläufige Quantifizierung durchgeführt, wobei die Bibliothek auf 1 ng/μl verdünnt wurde. Das Agilent 2100-System bewertete die Insertgröße und stellte sicher, dass sie den Erwartungen entsprach. Bibliotheken mit zufriedenstellenden Insertgrößen wurden genau quantifiziert (effektive Konzentration >2 nM) mittels qPCR, um die Qualität zu gewährleisten.

• Sequenzierung

Nach Bestehen der Bibliotheksinspektion wurden verschiedene Bibliotheken basierend auf der effektiven Konzentration und der erforderlichen Datenmenge für die Ziel-Downstream-Maschine zusammengefasst. Anschließend, Illumina-Sequenzierung wurde durchgeführt.

Qualitätskontrolle für cfDNA-RRBS

• Qualitätskontrolle von Sequenzierungsdaten

Die rohen downstream Daten umfassen Junction-Sequenzen, die während der Bibliothekskonstruktion eingeführt wurden, sowie niedrigqualitative Basen, was eine Filtration erforderlich macht, um diese zu eliminieren. Dieser Schritt ist entscheidend, da er die Anzahl der Reads erhöht, die an das Genom ausgerichtet sind, und somit die Informationsbeschaffung maximiert. Zufällige Primer werden entfernt von cfDNA-RRBS Bibliotheken aufgrund ihrer spezifischen Struktur.

• Datenqualitätsbewertung

Nach der Filtration der Rohdaten werden eine Bewertung der Sequierungsfehlerquoten und eine Untersuchung der Verteilung des GC-Gehalts durchgeführt.

• Vergleichende Qualitätsbewertung
• Nach der Qualitätskontrolle werden die Reads anhand der Sequenzähnlichkeit mit einem Referenzgenom verglichen. Bei dem Vergleich treten verschiedene Herausforderungen auf. cfDNA-RRBS-Daten im Vergleich zu traditionellen Genom- und Transkriptom-Sequenzierungen.
• Nicht-komplementäre Stränge: Nach der Bisulfit-Konversion hören die positiven und negativen DNA-Stränge auf, komplementär zu sein, was nach der PCR zu vier verschiedenen Sequenzen führt. Dies erhöht den Rechenaufwand für den Vergleich.
• Veränderte Sequenzzusammensetzung: Die Bisulfit-Konversion wandelt die meisten C-Basen in T um, was zu einer Sequenz mit hohem T-Gehalt und niedrigem C-Gehalt führt. Die PCR erzeugt einen komplementären Strang mit hohem A-Gehalt und niedrigem G-Gehalt, was die Sequenzkomplexität verringert und den Vergleich erschwert.
• Asymmetrischer Kontrast zwischen C und T: Nach der Bisulfit-Transformation werden demethylierte C-Basen (vorherrschend in der Sequenz) in T umgewandelt. Dies führt zu Fehlanpassungen zwischen der sequenzierten Sequenz und dem Referenzgenom, was die Ausrichtung erschwert.