RIP-Seq Probenvorbereitungsprotokoll

Zelllysat erhalten

1. Waschen Sie die Zellen in der Kulturplatte oder Kulturflasche zweimal mit kaltem PBS.
2. Fügen Sie kaltes PBS hinzu und kratzen Sie die Zellen mit einem Zellschaber ab und sammeln Sie sie in Eppendorf-Röhrchen.
3. Zentrifugieren Sie bei 1500 U/min für 5 Minuten bei 4°C, entsorgen Sie den Überstand und sammeln Sie die Zellen.
4. Resuspendieren Sie die Zellen mit demselben Volumen an RIP-Lysat wie die Zellen, gut durchmischen und 5 Minuten auf Eis stehen lassen.
Dispensieren Sie 200 μl Zelllysat in jedes Röhrchen und lagern Sie es bei -80°C.

Vorbereitung von magnetischen Perlen und Antikörpern

1. Resuspension von magnetischen Perlen.
2. Beschriften Sie die Eppendorf-Röhrchen, die für das Experiment benötigt werden.
Pipettiere 50 μl der resuspendierten Perlen in jedes Eppendorf-Röhrchen.
Fügen Sie 500 μl RIP-Waschpuffer zu jedem Röhrchen hinzu und schütteln Sie es im Vortex.
5. Stellen Sie die Eppendorf-Röhrchen auf einen Magnetständer, entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Vorgang einmal.
6. Resuspendieren Sie die Perlen mit 100 μl RIP-Waschpuffer.
7. Bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren.
8. Stellen Sie das Eppendorf-Röhrchen auf einen Magnetständer und entsorgen Sie die Überstände.
Fügen Sie 500 μl RIP-Waschpuffer hinzu, vortexen und schütteln, dann überstehende Flüssigkeit abgießen, diesen Schritt einmal wiederholen.
10. Fügen Sie 500 μl RIP-Waschpuffer hinzu, vortexen und schütteln Sie, und stellen Sie es dann auf Eis.

RNA-bindendes Protein-Immunpräzipitation

1. Bereiten Sie den RIP-Immunpräzipitationspuffer vor.
2. Stellen Sie die Eppendorf-Röhrchen aus dem vorherigen Schritt auf einen Magnetständer, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 900 µl RIP-Immunpräzipitationspuffer zu jedem Röhrchen hinzu.
3. Tauchen Sie den in Schritt 1 vorbereiteten Zelllysat schnell auf und zentrifugieren Sie ihn. Aspirieren Sie 100 μl des Überstands aus dem magnetischen Perlen-Antikörper-Komplex aus dem vorherigen Schritt, um ein Gesamtvolumen von 1 ml zu erreichen.
4. Inkubieren Sie 3 Stunden bei 4 °C bis über Nacht.
5. Zentrifugieren Sie kurz, platzieren Sie das Eppendorf-Röhrchen auf einem Magnetständer und entsorgen Sie die Überstände.
6. Fügen Sie 500 μl RIP-Waschpuffer hinzu, vortexen Sie und schütteln Sie das Eppendorf-Röhrchen auf dem Magnetständer, entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie das Waschen 6 Mal.

RNA-Reinigung

1. Bereiten Sie das Proteinase K-Puffer vor. 150 µl für jede Probe.
2. Resuspendieren Sie den oben genannten Komplex aus magnetischen Perlen und Antikörpern mit 150 µl Proteinase K-Puffer.
3. Inkubieren Sie bei 55 °C für 30 Minuten.
4. Nach der Inkubation das Eppendorf-Röhrchen auf einen Magnetständer stellen und das Überstand in ein neues Eppendorf-Röhrchen überführen.
Fügen Sie 250 μl RIP-Waschpuffer zu jedem Überstandröhrchen hinzu.
6. Fügen Sie 400 μl Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol zu jedem Röhrchen hinzu, vortexen und schütteln Sie, und zentrifugieren Sie bei 14.000 U/min für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
7. Vorsichtig 350 μl der oberen wässrigen Phase in ein neues Eppendorf-Röhrchen aspirieren.
Fügen Sie 400 μl Chloroform zu jedem Röhrchen hinzu, schütteln Sie es 15 Sekunden lang im Vortex und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei 14.000 U/min bei Raumtemperatur.
9. Ziehen Sie vorsichtig 300 μl der oberen wässrigen Schicht in ein neues Eppendorf-Röhrchen auf.
10. Fügen Sie 50 μl Lösung I, 15 μl Lösung II, 5 μl des Fällungsmittel-Verstärkers und 850 μl anhydrous Ethanol (ohne RNase) zu jedem Röhrchen hinzu, mischen Sie und lagern Sie bei -80°C für 1 Stunde bis über Nacht.
Zentrifugieren Sie bei 14.000 U/min, 4°C für 30 Minuten und entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
12. Einmal mit 80% Ethanol spülen, 15 Minuten bei 14.000 U/min bei 4°C zentrifugieren, Überstand vorsichtig entfernen und an der Luft trocknen.
Lösen Sie 10-20 μl DEPC in Wasser und lagern Sie es bei -80℃.