Musteranforderungen für mikrobielle Sequenzierung

Mit dem rasanten Fortschritt der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien wird unser Verständnis der Mikrobiota kontinuierlich verfeinert. Mikrobielle Sequenzierung erstreckt sich über eine Vielzahl von Proben, von den Böden auf hohen Gipfeln bis zu den sedimentären Schichten im Abgrund des Meeresbodens. Diese Vielfalt ermöglicht die Untersuchung der mikrobiellen Auswirkungen auf Umweltveränderungen und das Entschlüsseln physiologischer Rätsel, die in verschiedenen Organismen verborgen sind. Um aussagekräftige Sequenzierungsergebnisse zu erzielen, ist die strikte Einhaltung standardisierter Verfahren für die Probenentnahme und -einreichung von größter Bedeutung – eine grundlegende Voraussetzung für den Erfolg von Forschungsinitiativen.

Vor der Einreichung von Proben zur Sequenzierung ist es wichtig, die folgenden Punkte zu berücksichtigen:

Sterilisation von Probenahmewerkzeugen und -behältern: Stellen Sie sicher, dass die für die Probenahme verwendeten Werkzeuge und Behälter ordnungsgemäß sterilisiert wurden.

Rechtzeitige Kennzeichnung und Dokumentation: Kennzeichnen Sie die Proben unmittelbar nach der Entnahme und führen Sie detaillierte Aufzeichnungen über relevante Entnahmeinformationen.

Beispiel-Backup vor der Einreichung: Erstellen Sie Backups der Proben vor der Einreichung, um sich gegen unvorhergesehene Umstände abzusichern, die zum Verlust wertvoller Proben führen könnten.

Nutzung von Standardbehältern für die Probenübermittlung: Verwenden Sie Standardbehälter für die Einreichung von Proben und sorgen Sie für eine klare und genaue Kennzeichnung. Vermeiden Sie übermäßige Probenmengen bei der Einreichung.

Aufrechterhaltung von Niedrigtemperaturbedingungen während des Versands: Während des Versands sollte eine Niedrigtemperaturumgebung aufrechterhalten werden. Es wird empfohlen, Trockeneis für den Versand zu verwenden.

Die Aufmerksamkeit für diese Details ist entscheidend, um die Integrität und erfolgreiche Analyse der Proben im Kontext der mikrobiellen Sequenzierung zu gewährleisten.

Für verschiedene Arten von Umweltproben gelten folgende empfohlene Methoden zur Probenabgabe:

Umweltproben:

(1) Boden oder Sediment:

Sammeln Sie 5-10 g Boden und entfernen Sie Oberflächenabfälle.

Entnehmen Sie Boden aus einer Tiefe von 5-10 cm und kombinieren Sie Proben von mindestens drei Entnahmestellen für jedes Exemplar.

Legen Sie die Mischprobe in sterile Zentrifugenröhrchen.

Transportieren Sie die Proben bei Temperaturen unter 0 °C zurück ins Labor und lagern Sie sie bei -80 °C.

Für Sedimentproben mit höherem Feuchtigkeitsgehalt sammeln Sie mindestens 50 g.

Es wird empfohlen, Behälter mit einer Größe von nicht mehr als 15 ml Zentrifugenröhrchen für Bodenproben zu verwenden.

(2) Wasser:

Verwenden Sie 0,22 µm oder 0,45 µm Filtermembranen zur Filtration.

Filterwasservolumina von 5-10L, mit einer optimalen Filtermembranfläche von 3-4cm.

Lag die Filtermembran bei -80 °C.

Vermeiden Sie den direkten Versand von schwer zu öffnenden Behältern wie Filterhaltern, da dies die Probenentnahme während der Experimente komplizieren und die Projektzeitpläne beeinträchtigen könnte.

Für originale Wasserproben wird empfohlen, sie in 50 ml Zentrifugenröhrchen zu versenden. Wenn die Wasserprobe 50 ml überschreitet, filtern Sie sie bitte selbst und senden Sie die Filtermembran.

Pflanzenproben:

(1) Rhizosphären-Mikrobiota:

Sammeln Sie Rhizosphärenboden aus einer Tiefe von 20 cm und legen Sie ihn in sterile 50 ml Röhrchen.

Sieben Sie den Boden durch ein 20-Mesh-Sieb, um Pflanzenwurzeln, Tierreste und andere Verunreinigungen zu entfernen.

Platzieren Sie 3-5 g pro Tube, sofort verschließen und in flüssigem Stickstoff schockfrosten.

(2) Blattoberfläche:

Sammeln Sie 50-100 g Pflanzenmaterial und waschen Sie es mit sterilem Wasser.

Nach dem Waschen das sterile Wasser durch einen Membranfilter filtern und die Filtermembran bei -80°C aufbewahren.

(3) Endophytische Mikroben:

Verwenden Sie PBS, um Oberflächenbakterien zu entfernen.

Schneiden Sie das Pflanzengewebe, um endophytische Mikroben freizusetzen.

Legen Sie das Pflanzenmaterial in Wasser mit Glasperlen und schütteln Sie es.

Filtern Sie die Suspension durch eine 5µm Filtermembran.

Zentrifugieren Sie den Filtrat (15000 U/min, 4°C), um das mikrobielle Präzipitat zu sammeln.

Sammeln Sie die Mikroben in importierten Kryoröhrchen und lagern Sie sie bei -80 °C.

Aufgrund der Anfälligkeit endophytischer Mikroben für Kontaminationen durch Wirtszellen können extrahierte Nukleinsäuren eine erhebliche Menge an Wirts-DNA enthalten. Es sollten sorgfältige Maßnahmen ergriffen werden, um potenzielle Wirtskontaminationen während des Prozesses der Nukleinsäureextraktion zu vermeiden.

Fäkal- und Darbmuster:

(1) Menschliche Stuhlproben:

Sammeln Sie etwa 3 g (ungefähr die Größe einer Sojabohne) Stuhlmaterial.

Um eine Kontamination zu vermeiden, wird empfohlen, Urin zu entsorgen und einen sterilen Löffel zu verwenden, um interne Proben aus dem Stuhl zu entnehmen.

(2) Maus-Fäkalproben:

Sammeln Sie 0,5 g (3 Pellets) von Kotmaterial von Mäusen.

Platzieren Sie Mäuse in einem sauberen Käfig, der mit desinfiziertem Filterpapier ausgelegt ist, und sammeln Sie die Kotproben unmittelbar nach der Defäkation.

Verwenden Sie frisches Filterpapier für jede Maus, um Kreuzkontamination zu vermeiden.

Nach dem Sammeln der Proben sollten diese umgehend in importierte Kryoröhrchen gegeben und in flüssigem Stickstoff schockgefroren werden. Anschließend sollten sie bei -20 °C gelagert werden, und für die Langzeitlagerung ist eine Übertragung auf -80 °C empfehlenswert. Es wird empfohlen, Stuhlproben in Röhrchen mit einer schützenden Lösung zu versenden, um die Integrität der Proben während des Transports zu bewahren.

(3) Darminhalt: Zur Sammlung von Darminhalten:

Verwenden Sie ein steriles chirurgisches Messer, um einen longitudinalen Schnitt entlang des Verdauungstrakts zu machen.

Entnehmen Sie den Inhalt des Verdauungstrakts und legen Sie ihn in importierte Kryoröhrchen.

Sofort die Proben in flüssigem Stickstoff schockgefrieren und bei -80°C lagern.

Für große oder mittelgroße Tiere wie Rinder, Schafe, große Ratten und Kaninchen sammeln Sie 200-1000 mg pro Probe. Für kleine Tiere wie Mäuse sammeln Sie 200-500 mg pro Probe. Für Tiere mit begrenztem Darminhalt, wie Fische und Garnelen, sammeln Sie mindestens 100 mg pro Tube.

Mundproben

(1) Speichel:

Verwenden Sie einen vorgesehenen Speichelkollektor.

Weisen Sie die Person an, 2-3 Mal Speichel in den Sammler zu spucken (ca. 1 ml pro Spucke).

Fügen Sie dem gesammelten Speichel einen DNA-Stabilisator hinzu.

Übertragen Sie die Mischung in importierte Kryoröhrchen, frieren Sie sie umgehend in flüssigem Stickstoff ein und reichen Sie sie zur Analyse ein.

(2) Zahnbelag:

Fädel Zahnseide zwischen benachbarten Zähnen ein, um interdentalen Plaque zu sammeln.

Verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen, um Plaque von der okklusalen Fläche der hinteren Zähne zu entnehmen.

Nach der Entnahme die Proben in Probengläser mit einer Konservierungslösung geben.

Schnell 30 Sekunden lang schütteln, und die Proben können bei Raumtemperatur versendet werden.

Speichel-DNA-Entnahmeeinheit

Gewebeproben

(1) Darmmukosa:

Wählen Sie Segmente aus verschiedenen Teilen des Darms aus.

Schneiden Sie den intestinalen Abschnitt gegenüber dem Mesenterium vertikal ein, um das Darmlumen freizulegen.

Verwenden Sie einen sterilen Probennehmer, um Proben aus dem Darminhalt zu entnehmen und diese separat zu lagern.

Nach der Reinigung des Darminhalts spülen Sie das Darmlumen mit steriler Kochsalzlösung, um sichtbare Darminhalte zu entfernen (um die Schleimhaut nicht zu stören).

Sanft die Darmschleimhaut mit einem sterilen Glasobjektträger abkratzen (ohne die Basalmembran zu durchdringen).

Die Probenahmegröße sollte ungefähr der Größe eines Fingernagels entsprechen (etwa 0,8 cm * 0,8 cm).

Bewahren Sie die Proben in importierten Kryoröhrchen auf, frieren Sie sie schnell mit flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei -80 °C.

(2) Magen-Tumor:

Verwenden Sie Methoden wie die ruminale Fisteltechnik, das Einführen eines Magenschlauchs über den Mund oder die Nase oder Punktemethoden, um Mageninhalt zu sammeln.

Nach dem Durchlaufen von vier Schichten steriler Gaze zur Filtration, sammeln Sie die Magenflüssigkeit und lagern Sie sie bei -80°C.

(3) Blut:

Reinigen Sie die Venepunktionsstelle mit 70% Alkohol und warten Sie mindestens 60 Sekunden.

Führen Sie eine Venipunktur durch und entnehmen Sie 2 ml Vollblut in ein EDTA-Antikoagulantienröhrchen.

Kehren Sie das Antikoagulansröhrchen 8-10 Mal um, um das EDTA und das Vollblut gründlich zu mischen und eine effektive Antikoagulation sicherzustellen.

Bei -20 °C lagern.

(4) Haut:

Vermeiden Sie es, 24 Stunden vor der Probenentnahme zu baden, und verwenden Sie keine Feuchtigkeitscremes oder antibakteriellen Seifen.

Wählen Sie einen Bereich von etwa 4 cm * 4 cm (ungefähr die Größe von sechs Daumennägeln) zur Probenentnahme aus.

Sanft die Oberfläche der Haut mit einer sterilen chirurgischen Klinge abkratzen.

(5) Urinproben:

Sammeln Sie nüchternen, frischen Morgenurin, mit oder ohne Hämaturie.

Frauen sollten während der Menstruation auf Probenentnahmen verzichten und verhindern, dass vaginale Sekrete den Urin kontaminieren.

Sammeln Sie eine geeignete Menge an zufälligem Mittelstrahlurin, vorzugsweise 3 ml oder mehr, und lagern Sie ihn durch schnelles Einfrieren in flüssigem Stickstoff.

(6) Proben des Fortpflanzungstrakts:

Vermeiden Sie sexuelle Aktivitäten innerhalb von 48 Stunden und verzichten Sie darauf, die mikrobielle Struktur zu verändern, wie zum Beispiel durch Reinigung des Intimbereichs oder die Einnahme von Medikamenten, innerhalb von 30 Tagen.

Verwenden Sie einen sterilen Wattestäbchen, um eine ausreichende Probe zu entnehmen, tauchen Sie ihn in 2 mL PBS-Lösung in einem importierten Kryoröhrchen, entsorgen Sie den Wattestäbchen und frieren Sie ihn schnell in flüssigem Stickstoff ein.

Aufgrund der Schwierigkeit, Gewebeproben zu erhalten, stellen Sie sicher, dass Sie beim Versand von Gewebeproben Trockeneis verwenden.

Andere Probenarten:

(1) Oberflächenmikrobiota auf Objekten:

Legen Sie das Objekt in einen sterilen Behälter und fügen Sie eine geeignete Menge PBS hinzu, um das Objekt vollständig zu bedecken.

Verwenden Sie Geräte wie einen Schüttler, um zu rotieren und zu schütteln, wodurch die Oberflächenmikrobiota vom Objekt gelöst wird.

Sammeln Sie die Wasserprobe, führen Sie eine Niedertemperatur-Hochgeschwindigkeitszentrifugation durch und sammeln Sie das Präzipitat in einem importierten Kryoröhrchen.

Bei -80 °C lagern.

(2) Fermentierte Lebensmittel:

Bestimmen Sie das Probenvolumen basierend auf Überlegungen zum experimentellen Design.

Aufgrund der einzigartigen Beschaffenheit von fermentierten Lebensmitteln sollte die Probe in einem sterilen, versiegelten Behälter verpackt werden.

Bei -80 °C lagern.

Zusammenfassung:

Die Sicherstellung standardisierter Probenahme- und Lieferpraktiken ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Qualität der Proben, was letztendlich wünschenswerte Ergebnisse in den nachfolgenden Phasen der Extraktion, Bibliothekskonstruktion und Analyse garantiert.

Im Bereich der mikrobiologischen Forschung bietet CD Genomics umfassende Dienstleistungen an, die Folgendes umfassen mikrobielle Vielfalt, Metagenomik, und Metatranskriptomik-Sequenzierung Analysen:

Bevölkerungsvielfalt: Hauptsächlich durchgeführt durch 16S/18S/ITS-SequenzierungDieser Ansatz untersucht die Arten und die Häufigkeit von mikrobiellen Gemeinschaften innerhalb von Proben. Er ermöglicht den Vergleich von Unterschieden zwischen den Proben und deren Bedeutung auf Bevölkerungsebene und bietet Einblicke in die Variationen zwischen den Proben.

Funktionale Vielfalt: Durch den Einsatz von metagenomischer oder metatranskriptomischer Sequenzierung untersucht dieser Service Genarten, Häufigkeit und Unterschiede in der Expression innerhalb von Proben. Er erforscht die Evolution mikrobieller Gemeinschaften, die Wechselwirkungen zwischen Mikroben und ihrer Umgebung sowie die Beziehungen zwischen Mikroben und Wirten und deckt neuartige funktionale Gene auf und untersucht diese.

Integrierte Multi-Strategie-Analyse: Durch die Kombination 16S/18S/ITS-Sequenzierung, metagenomische Sequenzierung, Metatranskriptomik-Sequenzierungund Metabolomik wird eine umfassende Erkundung erreicht. Dies offenbart nicht nur mikrobielle Typen und Populationsstrukturen, sondern untersucht auch tiefgehend die Zusammenhänge zwischen Funktion und Genexpression. Darüber hinaus ermöglicht es das Studium der mikrobiellen Reaktionen auf Umweltveränderungen auf metabolischer Ebene.

Einzelne mikrobielle Arten-Sequenzierung: Diese Dienstleistung, die für kultivierbare Mikroben maßgeschneidert ist, nutzt die gesamte Genomsequenzierung von Bakterien oder die feine Kartierung von Pilzen, um die Genome der Arten zu entschlüsseln und Einblicke in die damit verbundenen Funktionen der Arten zu bieten.