Erforschung von CpG-Stellen durch Sequenzierungstechnologie

Was ist eine CpG-Insel?

CpG-Inseln sind spezialisierte Regionen im Genom, die häufig mit Dinukleotiden "CG" angereichert sind und insbesondere in den Promotorregionen vieler Gene vorkommen, insbesondere bei solchen, die mit grundlegenden Funktionen assoziiert sind. Diese CpG-Stellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren und beeinflussen die Genexpression. Der erhöhte Methylierungsstatus von CpG-Inseln moduliert weiter die Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren und hat somit Auswirkungen auf die Genregulation. Im Kontext der DNA-Methylierung bei Säugetieren überwiegt die CG-artige Methylierung, und CpG-Stellen, die reich an CpG-Dinukleotiden sind, befinden sich häufig in der Nähe von transkriptionalen Regulierungsregionen. Bemerkenswerterweise sind diese CpG-Inseln mit etwa 56 % der kodierenden Gene im menschlichen Genom verbunden, was die herausragende Bedeutung der Untersuchung ihres Methylierungsstatus im Bereich der Methylierungsforschung unterstreicht.

Die CpG-Dichte, die eng mit den DNA-Methylierungs dynamiken in verschiedenen Geweben verbunden ist, kategorisiert das Genom in fünf Regionen: CpG-Insel (CGI), den Bereich innerhalb von 2 kb stromabwärts der CpG-Insel (CpG-Shore) und die Zone innerhalb von 2 kb sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts der CpG-Insel-Shore (CpG-Shelve). Die Methylierungsniveaus jeder Region werden sorgfältig einzeln bewertet.

Anwendungen der CpG-Forschung

• Epigenetische Forschung: DNA-Methylierung spielt eine entscheidende Rolle bei der Erhaltung der normalen Zellfunktion, der Aufrechterhaltung der Chromosomenstruktur und der Ermöglichung der Inaktivierung des X-Chromosoms. Die Erforschung von CpG-Inseln trägt zur Weiterentwicklung der menschlichen epigenetischen Forschung bei.
• Früherkennung von Krebs: Erhöhte Methylierungsniveaus in Genpromotoren werden häufig bei der Transkription von Genen beobachtet, die mit bösartigen Tumoren assoziiert sind. Dieses Phänomen gilt als ein Kennzeichen der malignen Transformation von Zellen und ermöglicht die frühzeitige Erkennung von Krebs durch die Sequenzierung der Genmethylierung.
• Forschung zur embryonalen Entwicklung: DNA-Methylierung spielt eine zentrale Rolle bei der genetischen Prägung und der embryonalen Entwicklung. Studien zu CpG-Inseln bieten wertvolle Einblicke in das Verständnis der komplexen Prozesse, die an der embryonalen Entwicklung beteiligt sind.
• iPSC- und Stammzellforschung: CpG-Inseln sind entscheidend für die Analyse von Methylierungsmustern und bieten Einblicke in die Differenzierungsprozesse von Stammzellen und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs).

Bisulfid-Sequenzierung in der CpG-Forschung

BS-Seq (Bisulfid-Sequenzierung) hebt sich als die herausragende Methode zur umfassenden genomweiten Methylierungsdetektion hervor. Diese Technik beinhaltet die Umwandlung von unmethylierter Cytosine (C) zu Uracil (U) durch Bisulfidbehandlung. Durch die Integration von Sequenzierung der zweiten Generation und anschließender Analyse ermöglicht BS-Seq eine Hochdurchsatzdetektion von Methylierungsstellen.

Im Bisulfidbehandlungsprozess werden unmethylierte Cytosine in Uracil umgewandelt, während methylierte Cytosine unverändert bleiben. PCR-Primer werden sorgfältig basierend auf der Sequenz der Zielstelle oder des interessierenden Bereichs entworfen. Die amplifizierten Produkte werden verschiedenen Nachweismethoden unterzogen, darunter PCR-Elektrophorese, Sequenzierung, Fluoreszenzquantifizierung und Next-Generation Sequencing (NGS). Die erhaltenen Ergebnisse werden dann analysiert, um methylierte Stellen zu identifizieren und die Häufigkeit der Methylierung zu bestimmen.

Die Verfahrensschritte der BSP-Methode sind wie folgt:

• BSP-Primer-Design: Entwerfen Sie BSP-Primer, die auf die Zielgenregion zugeschnitten sind, wobei typischerweise ein Amplifikationsprodukt von etwa 300 Basenpaaren entsteht.
• Bisulfidbehandlung des Proben-Genoms: Behandeln Sie die genomische DNA mit Bisulfid, um die Umwandlung von unmethylierter Cytosine in Uracil zu induzieren.
• PCR-Amplifikation: Verwenden Sie PCR, um den interessierenden Bereich innerhalb der Probe zu amplifizieren.
• Klone in Vektor: Reinigen Sie die PCR-Produkte und ligieren Sie sie in gängige Vektoren.
• Plasmidextraktion und Sequenzierung: Extrahieren und sequenzieren Sie Plasmide aus einer Auswahl positiver Klone, wobei typischerweise 10 für die Inokulation und Kultur ausgewählt werden. Dieser Schritt ermöglicht die detaillierte Untersuchung von Methylierungsmustern auf molekularer Ebene.

Nanopore-Sequenzierung

Die ONT (Oxford Nanopore Technologies) Plattform unterscheidet den Methylierungsstatus von Basen, wie 5mC oder 6mA, indem sie die Veränderungen im elektrischen Signal analysiert, während die Base das Nanopore-Mikrowell durchquert.

Nanopore-Sequenzierung zeigt die bemerkenswerte Fähigkeit, direkt methylierte Cytosine, einschließlich derjenigen an CpG-Stellen, zu identifizieren, wodurch die Notwendigkeit einer Bisulfidumwandlung entfällt. Diese Technologie ist besonders gut darin, Methylierungsmuster in hochdichten Clustern, die als CpG-Inseln (CGIs) bekannt sind, zu erkennen.