Was ist Bulk-RNA-Sequenzierung?

Bulk-RNA-Sequenzierung, allgemein bekannt als Bulk-RNA-Seq, liefert Einblicke in die durchschnittlichen Genexpressionsniveaus innerhalb einer gesamten Gewebeprobe. Dieser Ansatz erweist sich als wertvoll für vergleichende Transkriptomik und Biomarker-Untersuchungen. Allerdings fehlt ihm die Fähigkeit, die nuancierte Heterogenität innerhalb von Geweben zu erfassen.

Bulk-RNA-Sequenzierungs-Workflow

Bulk-RNA-Seq, eine grundlegende Technik in der Transkriptomanalyse, hat fast zwei Jahrzehnte lang breite Anwendung gefunden und dient als wichtiges Werkzeug für Forscher. Ihre Nomenklatur, "Bulk", unterscheidet sie von dem späteren Aufkommen von Einzelzell-RNA-Seq. Die Breite von RNA-Seq Analysen umfassen Sequenzvergleich, Transkript-Spleißung, Expressionsquantifizierung, differentiellen Analyse, Fusion-Gen-Erkennung, variables Spleißen, RNA-Bearbeitung und Mutationsnachweis.

Betrachten Sie den Standardprozess, der durch gängige Plattformen der zweiten Generation für Kurz- und Langsequenzierung wie Illumina und SOLiD veranschaulicht wird:

• Konstruktion der Sequenzierungsbibliothek: Dieser erste Schritt umfasst die RNA-Extraktion, die cDNA-Synthese und die Hinzufügung von Junctions. Für die mRNA-Sequenzierung wird häufig Oligo (dT) verwendet, um mRNA anzureichern oder ribosomale RNA zu eliminieren.
• Sequenzierung auf Hochdurchsatzplattformen: Die vorbereitete Bibliothek wird auf einer Hochdurchsatzplattform sequenziert.
• Upstream-Datenanalyse: Diese Phase umfasst Qualitätskontrolle, Filterung, Vergleich (Ausrichtung/Kartierung), Quantifizierung und erweiterte Analyse von Spleißvarianten innerhalb sequenzierter Reads.
• Downstream-Analyse: Nach dem Erwerb der Expressionsmatrix werden verschiedene Methoden für das Data Mining eingesetzt.

Bulk-RNA-Sequenzierung ebnet den Weg für tiefgreifende Einblicke in die Dynamik der Genexpression und regulatorische Prozesse. Der Datenanalyse-Workflow umfasst:

• Differenzielle Expressionsanalyse: Diese Technik vergleicht Gene oder Transkripte und identifiziert signifikante Unterschiede zwischen verschiedenen experimentellen Gruppen.
• Clustering und Visualisierung: Proben unterliegen einer Clusteranalyse, um Muster der Genexpression zu verdeutlichen. Methoden wie Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA), Kohärenz-Clusteranalyse, nicht-negative Matrixfaktorisierung (NMF) und Zeitreihenanalyse werden eingesetzt.
• Anreicherungsanalyse: Techniken wie die Überrepräsentationsanalyse (ORA), die Gen-Satz-Anreicherungsanalyse (GSEA) und die Gen-Satz-Variationsanalyse (GSVA) decken angereicherte biologische Wege auf.
• Konstruktion von Regulierungs-/Interaktionsnetzwerken: Forscher erstellen komplexe Netzwerke, um regulatorische Mechanismen und Interaktionen innerhalb biologischer Systeme zu erläutern.

Umfassendes Protokoll zur Analyse von RNA-seq-Daten. (Sahraeian et al., 2017)

scRNA-seq vs. Bulk RNA-seq vs. Räumliche Transkriptomik

Bulk-RNA-Seq ist eine konventionelle Methode zur Sequenzierung von RNA in allen Zellen, indem RNA aus mehreren Zellen oder Geweben zusammengeführt wird. Dieser Ansatz bietet ein Gesamtprofil der Genexpression, das die gesamte Zellpopulation repräsentiert, und erleichtert die Identifizierung von unterschiedlich exprimierten Genen über Gewebe, Bedingungen oder Zeitpunkte hinweg.

Das Hauptziel von Bulk-RNA-Seq besteht darin, durchschnittliche Genexpressionsniveaus zwischen verschiedenen Bedingungen oder Proben zu vergleichen. Forscher verwenden es häufig, um Ausdrucksvariationen zwischen erkranktem und gesundem Gewebe zu analysieren und Gene mit signifikanten Ausdrucksänderungen zu identifizieren.

Bulk-RNA-Seq hat jedoch nicht die Fähigkeit, Ausdrucksunterschiede auf Einzelzellebene zu erkennen, was seltene Zellunterpopulationen, subtile transkriptionale Variationen oder zeitliche Genexpressionsdynamiken verschleiern kann. Folglich werden für Untersuchungen, die eine feinere Auflösung und Erkundung der Zellvielfalt erfordern, anspruchsvollere Techniken wie scRNA-Seq unerlässlich.

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) ermöglicht die Analyse der Genexpression innerhalb einzelner Zellen und bietet Einblicke in die zelluläre Heterogenität, die über die Möglichkeiten traditioneller RNA-Sequenzierungsmethoden wie Bulk-RNA-seq hinausgehen.

In scRNA-seq-Experimenten werden Zellen einzeln isoliert und ihre RNA extrahiert. Anschließend wird die RNA in cDNA umgeschrieben, gefolgt von Amplifikation und Sequenzierung. Diese hochauflösende Methodik ermöglicht die Identifizierung von Zelltypen, -zuständen und Subpopulationen und enthüllt verborgene zelluläre Vielfalt sowie seltene Zellcluster, die mit Bulk-RNA-seq nicht nachweisbar sind.

Der Schwerpunkt der scRNA-seq-Analyse liegt darin, die zelluläre Heterogenität zu erforschen und verschiedene Zelltypen oder -zustände zu unterscheiden. Mit scRNA-seq werden Genexpressionsdaten für jede Zelle erfasst, was ein nuanciertes Verständnis der zellulären Unterschiede und Diversität ermöglicht.

Darüber hinaus verwendet scRNA-seq Clusteranalysetechniken, um Zellen basierend auf ihren Genexpressionsprofilen in Untergruppen zu kategorisieren, wodurch sowohl Ähnlichkeiten als auch Unterschiede zwischen den Zellen aufgedeckt werden. Durch die Annotation bekannter Zellmarker-Gene können Forscher neu entdeckte Zelltypen validieren und klassifizieren.

Darüber hinaus ermöglicht scRNA-seq die Identifizierung von Genen, die spezifisch während verschiedener Entwicklungsstadien, in unterschiedlichen Gewebetypen oder unter bestimmten Krankheitsbedingungen exprimiert werden.

Tabelle 1 Unterschiede zwischen scRNA-seq, Bulk-RNA-Sequenzierung und räumlicher Transkriptom-Sequenzierung

Wie wählt man die richtige RNA-Sequenzierungstechnologie aus?

Die Einzelzellsequenzierung, die Bulk-RNA-Sequenzierung und die räumliche Transkriptomsequenzierung bieten jeweils einzigartige Vorteile und stoßen auf spezifische Einschränkungen. Die Integration aller drei Ansätze kann jedoch individuelle Nachteile mindern und zu einer umfassenderen, genaueren und aufschlussreicheren Analyse biologischer Phänomene führen.

Die wichtigsten Vorteile der kombinierten Analyse sind:

• Umfassende Einblicke in zelluläre Expressionsprofile und räumliche Organisation: Die Einzelzell-Sequenzierung liefert detaillierte Genexpressionsprofile einzelner Zellen, während die räumliche Transkriptom-Sequenzierung Informationen über die räumliche Lage innerhalb von Geweben offenbart. Durch die Kombination dieser Ansätze kann ein tieferes Verständnis der Zellfunktionen und Interaktionen innerhalb von Geweben erlangt werden.
• Verbesserte Datenqualität und Zuverlässigkeit: Batch-Effekte und technisches Rauschen, die bei der Einzelzell-Sequenzierung und der Bulk-RNA-Sequenzierung auftreten, können durch die räumliche Transkriptom-Sequenzierung identifiziert und korrigiert werden. Diese Integration hilft, potenzielle falsch-positive Ergebnisse zu mindern und verbessert somit die allgemeine Zuverlässigkeit der Daten.
• Ganzheitliches Verständnis biologischer Komplexität: Die kombinierte Analyse erstreckt sich über mehrere Ebenen, von den molekularen Eigenschaften einzelner Zellen bis hin zum umfassenderen Kontext ganzer Gewebe. Dadurch ermöglicht sie eine umfassendere Interpretation der komplexen und vielfältigen biologischen Phänomene.

Insofern stellt die Integration dieser drei Sequenzierungsmethoden einen entscheidenden Trend und Entwicklungspfad in der biologischen Forschung dar.

Fall: Multi-Skalige RNA-Sequenzierungsanalyse der Tumormikroumgebung von TNBC und Vorhersage der ICI-Reaktion

Forschungsziel

Triple-negatives Brustkrebs (TNBC) weist eine bemerkenswerte Prävalenz von Defekten in der homologen Rekombination (HRDs) auf, die sich als entscheidende Biomarker herausgestellt haben, die die Reaktion auf Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs) beeinflussen. Diese Studie hatte zum Ziel, den Einfluss von HRDs auf das Tumormikroumfeld (TME) über mehrere Skalen hinweg zu beleuchten, indem Daten aus Einzelzell-, räumlicher und Bulk-RNA-Sequenzierung genutzt wurden. Darüber hinaus sollte die Untersuchung prädiktive Modelle für die Behandlungsreaktion basierend auf den TME-Eigenschaften erstellen, wobei maschinelle Lernalgorithmen in 11 ICI-Behandlungsgruppen verwendet wurden.

Einzelzell-, räumliche und Bulk-RNA-Sequenzierung wurden gesammelt, um die Rolle von HRD bei der Entwicklung des TME auf mehreren Ebenen zu untersuchen. (Kang et al., 2023)

Wichtigste Erkenntnisse

• Einzelzell-Analyse des Einflusses von HRD: Einzelzell-RNA-seq-Daten von acht TNBC-Proben, bestehend aus vier HRD- und vier Nicht-HRD-Proben, wurden analysiert. Der Vergleich der Zelltypverteilungen zwischen den beiden Gruppen zeigte einen höheren Anteil an Immunzellen und stromalen Zellen in der HRD-Kohorte. Der beobachtete Anstieg der infiltrierenden Lymphozyten in der HRD-Gruppe deutet auf eine potenzielle Assoziation mit einer erhöhten Neoantigenexpression hin, die auf HRDs zurückzuführen ist.
• Räumliche RNA-seq-Einblicke in die TME-Architektur: Eine räumliche RNA-seq-Analyse wurde an vier nicht-HRD TNBC-Proben durchgeführt, um die räumlichen Beziehungen zwischen verschiedenen Zelltypen zu delineieren. Anreicherungsfraktionen für jeden Zelltyp wurden abgeleitet und innerhalb jeder räumlichen RNA-seq-Probe korreliert. Bemerkenswerterweise wiesen Myofibroblasten (myCAFs) und entzündliche CAFs (iCAFs) auf räumlicher Ebene eine signifikante gegenseitige Exklusivität auf.

myCAFs Dominanz im TME: Innerhalb von Loci, die als krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs) gekennzeichnet sind, wiesen myCAFs deutlich höhere Anreicherungswerte auf, was mit ihrer vorherrschenden Präsenz im TME von nicht-HRD-Proben übereinstimmt.

Validierung der Korrelation zwischen DPP4 und myCAFs: Die Anreicherungswerte von myCAFs an DPP4+ Loci waren signifikant höher als die an DPP4- Loci, was die Assoziation zwischen DPP4-Expression und der Häufigkeit von myCAFs auf räumlichen Skalen untermauert. Darüber hinaus zeigte DPP4 eine stärkere Korrelation mit myCAFs im Vergleich zu iCAFs, was auf seine potenzielle Relevanz bei der Gestaltung der Dynamik des TME hinweist.

Diese Ergebnisse unterstreichen das komplexe Zusammenspiel zwischen HRDs, der Zusammensetzung des TME und der Behandlungsreaktion bei TNBC. Die Integration von Einzelzell-, räumlichen und Bulk-RNA-Sequenzierungsdaten, kombiniert mit maschinellen Lernverfahren zur prädiktiven Modellierung, bietet neuartige Einblicke in die molekularen Grundlagen der TNBC-Pathogenese und der therapeutischen Ergebnisse.

Referenzen:

1. Kang, Kai, et al. "Homologe Rekombinationsdefizienz bei triple-negativem Brustkrebs: Multi-Skalen-Transkriptomik offenbart unterschiedliche Tumormikroumgebungen und Einschränkungen bei der Vorhersage der Immuntherapieantwort." Computer in Biologie und Medizin 158 (2023): 106836.
2. Sahraeian, Sayed Mohammad Ebrahim, et al. "Um umfassende biologische Einblicke in das Transkriptom zu gewinnen, wird eine breit angelegte RNA-seq-Analyse durchgeführt." Naturkommunikationen 8.1 (2017): 59.