Übersicht über die RRBS-Datenanalyse: Pipeline, Ausrichtungswerkzeuge, Datenbanken und Herausforderungen

Die rasante Entwicklung von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien bietet nun die Möglichkeit, DNA-Methylierung mit hoher Abdeckung und in Einzelbasenauflösung im großen Maßstab zu untersuchen. Bisulfit-Sequenzierung ist der Goldstandard zur Messung der Methylierung über die interessierenden Genome (Wreczycka et al., 2017). Die reduzierte Repräsentation Bisulfid-Sequenzierung (RRBS) wurde aufgrund der erheblich reduzierten Sequenzierungskosten sowie der hohen Sequenzierungsabdeckung und Sensitivität (Gu et al., 2010; Meissner et al., 2005) umfassend zur Untersuchung der genomweiten DNA-Methylierung eingesetzt.

Einführung in RRBS

RRBS ist eine standardisierte Methode, die umfassend für die DNA-Methylierungsanalyse eingesetzt wird und die Methylierungsmuster in Genomen präzise beschreibt, indem sie Sequenzierungstechnologie in Kombination mit bioinformatischer Analyse nutzt. Diese Methode bietet den Vorteil einer hochauflösenden Analyse auf Einzelbasenebene, wodurch eine präzise Bewertung des Methylierungsstatus jeder Cytosinbase ermöglicht wird, und das zu bemerkenswerten Kosten. Die Anwendung von RRBS umfasst ein breites Spektrum in der Biologie und medizinischen Forschung. Es wurde umfassend genutzt, um verschiedene Themen zu untersuchen, wie Risikofaktoren für Krankheiten, genetische Merkmale, Entdeckung von Biomarkern, Tumorbildung, psychische Störungen, Stoffwechselerkrankungen, Autoimmunerkrankungen sowie Verbesserungen in Pflanzen- und Tierzuchtprogrammen und reproduktiver Forschung.

Anwendung von RRBS

RRBS dient als ein potentes Mittel zur Erforschung von genomweiten Methylierungsmustern und unterstützt Forscher dabei, Methylierungslandschaften in verschiedenen genomischen Regionen zu kartieren, die Promotoren, intergenische Bereiche, Introns und Transkriptionsstopps umfassen. Solche Untersuchungen enthüllen die funktionale Rolle der DNA-Methylierung bei der Orchestrierung der Genregulation und im weiteren Kontext der epigenetischen Vererbung. Durch den Vergleich der Methylierungsniveaus über verschiedene Proben hinweg können unterschiedlich methylierten Stellen identifiziert werden - genomische Positionen, die bemerkenswerte Variationen in ihrem Methylierungsstatus unter verschiedenen physiologischen Zuständen, Krankheitsbedingungen oder Umweltumständen aufweisen. Diese Erkenntnisse spielen eine bedeutende Rolle beim Entschlüsseln der Krankheitsentstehung, der Identifizierung potenzieller Biomarker und dem Verständnis der Auswirkungen von Umweltfaktoren auf die Genom-Methylierung.

RRBS wird häufig in der Krebsforschung eingesetzt. Durch den Vergleich von Methylierungsunterschieden zwischen krebsartigen Proben und ihren normalen Gegenstücken kann RRBS die Entdeckung von Methylierungsmarkern erleichtern, die für den Beginn und die Progression von Krebs relevant sind. Dieser Ansatz ist entscheidend für die frühzeitige Krebsdiagnose, die Identifizierung therapeutischer Ziele und die Aufklärung der Mechanismen der Tumorentwicklung. Darüber hinaus können RRBS-Daten auch erheblich zur epigenetischen Forschung beitragen, einschließlich der Analyse von gewebespezifischen Methylierungsmustern, der Untersuchung interindividueller genetischer Variationen in der Methylierung und der Erforschung der Auswirkungen von Umweltfaktoren auf die genomische Methylierung.

RRBS wurde in der Landwirtschaft umfassend eingesetzt, um die Entwicklung von Pflanzen, ihre Anpassungsfähigkeit und agronomische Merkmale zu untersuchen. Durch den Vergleich von Methylierungsmustern verschiedener Pflanzenvarianten können spezifische Methylierungsmarker identifiziert werden, die mit wichtigen agronomischen Eigenschaften wie Ertrag, Qualität und Widerstandsfähigkeit verbunden sind. Diese Erkenntnisse unterstützen die Auswahl überlegener Sorten und gezielte genetische Verbesserungen, wodurch sowohl der Ertrag als auch die Umweltverträglichkeit erhöht werden können. RRBS unterstützt die Forschung zu den dynamischen Veränderungen der DNA-Methylierung während des Wachstums und der Entwicklung von Pflanzen. Eine Analyse der Methylierungsmuster in verschiedenen Wachstumsphasen oder in unterschiedlichen Organen kann die Rolle der genomischen Methylierung bei der Steuerung von Wachstumsprozessen entschlüsseln und Methylierungsstellen sowie Netzwerke aufdecken, die mit der Wachstumsregulation in Verbindung stehen.

Darüber hinaus, RRBS Daten können kombiniert werden mit RNA-Sequenzierung Daten zur Durchführung korrelationaler Analysen zwischen Methylierung und Genexpression. Durch die Verknüpfung von Methylierungsstellen mit Genexpressionsniveaus kann die regulatorische Rolle der Methylierung in der Genexpression aufgedeckt werden, und regulatorische Netzwerke, die für spezifische biologische Prozesse oder Krankheiten relevant sind, können identifiziert werden.

RRBS-Datenanalyse-Pipeline

Die Analyse von DNA-Methylierungsmustern auf genomweiter Ebene ist entscheidend für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der DNA-Methylierung. Die rechnerische Pipeline zur Analyse von RRBS Die Daten sind in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1. Pipeline zur Analyse von RRBS-Daten. CpG: CG-Sequenzen, C ist Cytosin und G ist Guanin. CHG und CHH: H ist A (Adenin), C oder T (Thymin).

Die Analyse von RRBS Daten umfassen typischerweise die folgenden Schritte:

Qualitätskontrolle: Die Qualitätskontrolle ist der erste Schritt in der Datenanalyse und gewährleistet eine hohe Datenqualität und Zuverlässigkeit. In diesem Schritt werden typischerweise Werkzeuge wie FastQC eingesetzt, um die Qualität von Rohsequenzierungsdaten zu bewerten. Diese Werkzeuge untersuchen Metriken wie die Verteilung der Basisqualität, den GC-Gehalt, die Verteilung der Sequenzlängen und Überrepräsentation, um Kontaminationen, niedrigqualitative Sequenzen oder andere Probleme zu identifizieren, sodass geeignete Filter- und Trimmmaßnahmen ergriffen werden können.

Ausrichtung an Referenzgenom: Sobald die Qualitätskontrolle abgeschlossen ist, werden die gefilterten Sequenzierungsdaten an ein Referenzgenom ausgerichtet. In RRBS Datenanalyse, aufgrund der Methode, die auf spezifische DNA-Fragmente abzielt, muss der Alignierungsprozess die Spezifität der Enzymspaltstellen berücksichtigen. Zu den gängigen Alignierungswerkzeugen gehören Bismark, BSseeker2 usw. Die Alignierungsergebnisse werden typischerweise im SAM- oder BAM-Format gespeichert, um anschließend methylierten Stellen zu identifizieren und zu analysieren.

Identifizierung von methylierten Stellen: Nach der Ausrichtung der Daten entsteht das Gebot, methylierten Stellen zu identifizieren. Dieser entscheidende Schritt erfolgt typischerweise in zwei Phasen: der ausrichtungsbasierten Identifikation und der anteilsbasierten Identifikation. Erstere basiert darauf, methylierte Stellen zu erkennen, indem methylierte Sequenzen mit dem Referenzgenom verglichen werden. Im Gegensatz dazu beinhaltet der letztere Ansatz die Schätzung der Methylierungsniveaus an jeder Stelle durch statistische Analyse.

Schätzung der Methylierungsniveaus: Sobald die methylierten Stellen identifiziert wurden, besteht die nächste Aufgabe darin, ihre Methylierungsgrade zu quantifizieren. Typischerweise beinhaltet dies die Schätzung der Methylierungsgrade, indem das Verhältnis von methylierten zu unmethylierten Fragmenten innerhalb der Sequenzierungsdaten berechnet wird. Diese Verhältnisse werden häufig als Beta-Werte (β-Werte) oder Methylierungsverhältnisse bezeichnet. Durch eine solche Schätzung können Einblicke in den Grad der Methylierung an verschiedenen genomischen Loci gewonnen werden, was unser Verständnis von epigenetischen Modifikationen verbessert.

Abbildung 2. MD-Diagramm, das den log-Fold-Change des Methylierungsniveaus und die durchschnittliche Häufigkeit jedes CpG-Stellen zeigt. (Chen et al., 2017)

Differenzielle Methylierungsanalyse: Nach der Schätzung des Methylierungsniveaus vergleicht die Analyse der differentiellen Methylierung die Methylierungsniveaus zwischen verschiedenen Proben, um unterschiedlich methylierte Stellen zu identifizieren. Diese Analyse verwendet häufig statistische Methoden (z. B. limma, edgeR, DMRcate), um signifikante Unterschiede in den Methylierungsniveaus zu testen und unterschiedlich methylierte Stellen basierend auf festgelegten Schwellenwerten zu bestimmen.

Funktionale Annotation: Die funktionale Annotation von unterschiedlich methylierten Stellen hilft, ihre genomische Verteilung und biologischen Funktionen zu verstehen. Dieser Schritt umfasst typischerweise die Nutzung von genomischen Annotationsinformationen wie Genstrukturen, Promotorregionen, Enhancern usw. Die Zuordnung unterschiedlich methylierten Stellen zu biologischen Funktionen untersucht weiter die biologische Bedeutung der Methylierung.

Weganalyse: Nach der Analyse der differentiellen Methylierung wird häufig eine Pfadanalyse an differentiell methylierte Gene durchgeführt, um deren funktionale Wege und Interaktionsnetzwerke in biologischen Prozessen zu verstehen. Die Pfadanalyse nutzt typischerweise bioinformatische Datenbanken und Werkzeuge (z. B. DAVID, Enrichr, GSEA), um biologische Wege und funktionale Module zu identifizieren, die mit differentiell methylierten Genen assoziiert sind.

RRBS-Datenanalysetools

Aufgrund der Komplexität von Bisulfite-Sequenzierungs-Alignments (die ausgerichteten Sequenzen stimmen nicht genau mit dem Referenzgenom überein, und die Komplexität der Bibliotheken ist reduziert), kann Standard-Software zur Sequenzausrichtung nicht verwendet werden. Aufgrund der einzigartigen Eigenschaften von RRBSFür die Ausrichtung und Analyse sind spezielle Werkzeuge erforderlich. Fünf häufig verwendete Mapping-Algorithmen für die Benchmarking-Analyse in RRBS-Daten sind Bismark, BS-Seeker2, BSMAP, GSNAP und bwa-meth, die in Tabelle 1 aufgeführt sind (Sun et al., 2018).

Tabelle 1. Kurze Beschreibung verschiedener Ausrichtungswerkzeuge für die Analyse von RRBS-Daten.

Bismark ist ein weit verbreitetes Werkzeug zur Analyse von RRBS-Daten aufgrund seiner Effizienz, Genauigkeit und hohen Zuverlässigkeit. Es kann die Eigenheiten, die in RRBS Daten, wie das Vorhandensein von Schnittstellen für Restriktionsenzyme und die Heterogenität der DNA-Methylierung. Ein Nachteil ist jedoch die langsamere Verarbeitungsgeschwindigkeit bei groß angelegten Daten, insbesondere bei größeren Genomen. Bismark kann verwendet werden, um auszurichten. RRBS-Sequenzierung Daten zu einem Referenzgenom zuordnen sowie Methylierungsstellen identifizieren und analysieren.

Im Gegensatz dazu stellt BSseeker2 ein weiteres beliebtes Werkzeug zur Analyse von RRBS-Daten dar, das für seine starke Leistung bei der Verarbeitung von großangelegten Daten und schnelleren Ausrichtungszeiten bekannt ist. Die Installation und Konfiguration von BSseeker2 könnte im Vergleich zu anderen Werkzeugen etwas mehr Aufwand erfordern. Dennoch erweist es sich als kompetent bei der Zuordnung von RRBS-Sequenzierungsdaten, der Erkennung von Methylierungsstellen und der Durchführung von differentiellen Methylierungsanalysen.

BSMAP, obwohl einfach und praktisch in der Nutzung mit einem unkomplizierten Installations- und Konfigurationsprozess, glänzt hauptsächlich bei kleinen Anwendungen. RRBS Daten aufgrund ihrer hohen Genauigkeit. Allerdings könnte es nicht so wirksam sein wie andere Algorithmen im Umgang mit komplexen Methylierungsmustern.

GSNAP ist vielseitig einsetzbar, nicht nur zur Ausrichtung von DNA-Sequenzierungsdaten, sondern auch von RNA-Sequenzierungsdaten und anderen Anwendungen. Es zeigt eine robuste Leistung im Umgang mit komplexen genomischen Datensätzen und weist eine hohe Ausrichtungsgenauigkeit auf. Ein Nachteil ist jedoch die potenziell langsamere Verarbeitung von großflächigen RRBS-Daten sowie die relativ komplexe Konfiguration und Nutzung.

bwa-meth, speziell für Methylierungsdaten entwickelt, eignet sich besonders gut für die Verarbeitung von RRBS und ähnlichen Methylom-Sequenzierungsdaten. Es arbeitet hervorragend bei der Handhabung von kleineren Datensätzen. RRBS Daten, die mit hohen Ausrichtungsgeschwindigkeiten prahlen. Dennoch kann die Verwaltung bestimmter spezialisierter Fälle komplex sein.

MethylDackel, ein leichtgewichtiges Tool, spezialisiert sich auf das Ausrichten und Identifizieren von methylierten Stellen in RRBS- und anderen Methylom-Sequenzierungsdaten. Es zeichnet sich durch seine Effizienz und Einfachheit aus, was es geeignet macht, um kleine RRBS-Datensätze zügig zu verarbeiten. Dennoch könnte seine Funktionalität vergleichsweise grundlegend sein und die umfangreichen Analysefähigkeiten anderer Tools vermissen lassen. MethylDackel findet Anwendung bei der schnellen Verarbeitung von moderat großen RRBS Daten und Durchführung der vorläufigen Identifizierung von Methylierungsstellen.

Trim Galore funktioniert typischerweise als ein Preprocessing-Tool, das der Qualitätskontrolle und Filterung dient. RRBS Daten. Es erkennt automatisch und schneidet Sequenzen von geringer Qualität innerhalb von Sequierungsdaten, wodurch die Datenqualität verbessert wird. Trim Galore selbst führt jedoch keine Ausrichtung oder Identifizierung von Methylierungsstellen durch und erfordert die Integration mit anderen Tools für eine umfassende Analyse.

DNA-Methylierungsdatenbanken

Den der Speicherung und Verwaltung von DNA-Methylierungsdaten gewidmet, sind DNA-Methylierungsdatenbanken unverzichtbare Ressourcen, die einen erheblichen Bestand an Methylierungsdaten zusammenstellen, die verschiedene Arten von Spezies, Zelltypen, Gewebetypen und physiologischen Zuständen umfassen. Diese Datenbanken bieten typischerweise verschiedene Datentypen, die umfassende Methylierungsdaten des gesamten Genoms, annotierte Informationen zu Methylierungsloci, Methylierungslandschaften sowie Funktionen und Regelungen von Methylierungsmodifikationen umfassen. Angesichts des großen Volumens an Methylierungsdaten, die diese Datenbanken enthalten, können Forscher die Verteilung, Regulierung und Funktionen der DNA-Methylierung im gesamten Genom untersuchen, indem sie die verfügbaren Daten durchsuchen und analysieren. Darüber hinaus können sie den Forschern helfen, die Rollen und Mechanismen der DNA-Methylierung in biologischen Prozessen, einschließlich der Genexpression, Zell-Differenzierung, Entwicklung und Krankheitsprogression, zu verstehen. Forschungen, die auf DNA-Methylierungsdaten basieren, erfordern die Entwicklung und Bereitstellung verschiedener bioinformatischer Werkzeuge und Algorithmen, und diese Datenbanken bieten eine wichtige Datensatzbasis und Verifizierungsplattform für die Werkzeugentwicklung.

Häufige DNA-Methylierungsdatenbanken umfassen:

UCSC-Genombrowser: Als online genomischer Browser bietet der UCSC Genome Browser umfassende Methylierungsdaten für verschiedene Arten. Benutzer können auf verschiedene Methylierungsdatensätze zugreifen, die unterschiedliche Gewebe, Zelltypen und Krankheitszustände abdecken.

KODIEREN: Das ENCODE (Enzyklopädie der DNA-Elemente) Projekt ist ein umfassendes Forschungsunternehmen, das darauf abzielt, funktionale Elemente im menschlichen Genom zu identifizieren und zu annotieren. Diese Initiative aggregiert große Mengen funktionaler genomischer Daten, einschließlich Daten zur DNA-Methylierung, und bietet Forschern umfassende Ressourcen zur funktionalen Annotation des Genoms.

Fahrplan Epigenomik-Projekt: Das Roadmap Epigenomics Project ist eine großangelegte internationale Zusammenarbeit, die darauf abzielt, epigenomische Karten für Menschen und Modellorganismen zu erstellen. Es sammelt verschiedene epigenomische Daten, einschließlich Daten zur DNA-Methylierung, und bietet Forschern reichhaltige epigenomische Ressourcen.

TCGA: Das Cancer Genome Atlas (TCGA) ist ein großangelegtes internationales Projekt, das genomische Daten aus verschiedenen Krebsproben sammelt. Es umfasst erhebliche Mengen an Methylierungsdaten aus Krebsproben und stellt eine wichtige Ressource für die Krebsforschung dar.

DDBJ/EMBL/GenBank: DDBJ (DNA-Datenbank von Japan), EMBL (Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie) und GenBank stellen drei wichtige genomische Sequenzdatenbanken dar, die genomische Sequenzen und verwandte biologische Informationen in globalem Maßstab kuratieren, einschließlich Daten zur DNA-Methylierung.

GEO: GEO (Gene Expression Omnibus) dient als öffentliches Repository für genomische Daten und sammelt umfangreiche Datensätze zur Genexpression und Epigenomik, einschließlich Daten zur DNA-Methylierung.

In den letzten Jahren wurden durch die auf NGS basierenden Technologien zur DNA-Methylierungserkennung eine große Menge an Daten generiert. Mehrere Methylierungsdatenbanken wurden entwickelt, um diese Daten zu speichern, und sind für Forscher verfügbar (Tabelle 2) (Su et al., 2012). Mit der Entwicklung einer Studie zur DNA-Methylierung werden weitere Datenbanken eingerichtet, und es wird mehr Informationen über Methylierung bekannt werden.

Tabelle 2. DNA-Methylierungsdatenbanken.

Herausforderungen bei der Methylierungsbestimmung in der RRBS-Datenanalyse

Es gibt zwei Schlüsselfaktoren, die die Genauigkeit der Methylierungsaufrufe bei der Bestimmung des Methylierungsstatus von Bisulfit-Sequenzierungsreads beeinflussen. Erstens müssen die Sequenzierungsreads korrekt sein und vollständig aus bisulfit-konvertierten Sequenzen stammen. Zweitens müssen die Reads korrekt auf das Referenzgenom abgebildet werden. Das Versagen dieser beiden Faktoren führt zur Generierung falscher Methylierungsaufrufe. In extremen Fällen kann das Rauschen aus diesen Fehlaufrufen die Schlussfolgerungen des Experiments negativ beeinflussen (Krueger et al., 2012). Der Prozess der Verdauung durch Restriktionsenzyme (häufig unter Verwendung des Restriktionsendonukleasen MspI), der Bisulfit-Konversion und der Sequenzierung, der dabei beteiligt ist, RRBS würde diese beiden Faktoren beeinflussen.

• MspI Verdauung

Die MspI-Digestion würde zu einer breiten Palette von DNA-Fragmenten in unterschiedlichen Größen führen (Abbildung 3), und normalerweise werden Fragmente zwischen 40 und 220 bp für die RRBS-Bibliothek größenselektiert. Während des Prozesses werden auch einige MspI-digestierte Fragmente, die kürzer als 40 bp sind, erzeugt. Wenn der Größenselektionsprozess nicht so gut ist wie theoretisch angenommen, kann oft eine beträchtliche Anzahl von Fragmenten unter 40 bp in die RRBS Bibliothek.

Abbildung 3. Die relativen Häufigkeiten der MspI-Fragmentgrößen im menschlichen Referenzgenom. (Suzuki et al., 2010)

Die kürzeren Fragmente haben eine höhere Wahrscheinlichkeit, sequenziert zu werden als größere (≥300 bp) Fragmente. Kurze Reads in den Bisulfid-Sequenzierungsdaten könnten jedoch zu einer niedrigen Mapping-Effizienz in der Datenanalyse führen (Abbildung 4).

Abbildung 4. Leistung der methylierungsbewussten Zuordnung (verzerrt) und der unverzerrten Zuordnung für Methylierungssequenzierungsdaten. (Krueger et al., 2012)

• Bisulfit-Konversion

Die Bisulfitbehandlung von DNA vermittelt die Deaminierung von unmethyliertem Cytosin zu Uracil, und diese umgewandelten Reste werden als Thymin gelesen, was durch PCR-Amplifikation und anschließende Sequenzanalyse bestimmt wird (Abbildung 5).

Abbildung 5. Das Prinzip der Bisulfit-Sequenzierung.

Bisulfid-Sequenzierung basiert auf der Umwandlung jedes einzelnen unmethylierter Cytosin-Rests in Uracil. Unvollständige Umwandlung kann zu falsch positiven Ergebnissen führen, da die nicht umgewandelten unmethylierter Cytosine fälschlicherweise als methylierte Cytosine interpretiert werden (Abbildung 6).

Abbildung 6. Unvollständige Bisulfit-Konversion.

• Sequenzierung

Aufgrund der kurzen, größenselektierten Fragmentgröße in der RRBS-Bibliothek würden mehrere Faktoren im Sequenzierungsprozess die beeinflussen. RRBS Datenanalyse (Krueger et al., 2012):

Basisaufrufqualitäten: Die Qualität der Basisaufrufe neigt dazu, zu sinken, je länger die Reads sind. Die schlechten Basisqualitäten würden zu falschen Methylierungsaufrufen und/oder Fehlzuordnungen führen.

Basisaufruf-Fehler: Die Sequenzierungsfehler in den Reads können zu einer niedrigen Mapping-Effizienz führen (Reads werden überhaupt nicht ausgerichtet), falschen Methylierungsaufrufen oder Fehlanpassungen, die ebenfalls höchstwahrscheinlich zu falschen Methylierungsaufrufen führen.

Adapterkontamination: In vielen Bibliotheken wird ein Teil der Reads durch den Insert laufen und beginnen, den Adapter am 3'-Ende zu sequenzieren. Eine solche "Adapterkontamination" kann zu niedrigen Mapping-Effizienzen führen, wenn der Read nicht ausgerichtet werden kann, oder, wenn er ausgerichtet wird, zu falschen Ausrichtungen führen, die zu inkorrekten Methylierungsaufrufen führen können.

Endreparatur: Die während der Endreparatur ausgefüllten Positionen geben den Methylierungszustand des Cytosins an, das für die Fill-in-Reaktion verwendet wurde, jedoch nicht das tatsächliche genomische Cytosin.

Paar-End-Sequenzierung: Paar-End RRBS-Sequenzierung (insbesondere bei langen Leselängen) liefern redundante Methylierungsinformationen, wenn die Lese-Paare überlappen.

Bei CD Genomics sind wir bestrebt, zuverlässige Epigenomik-Sequenzierung Dienstleistungen, einschließlich gezielte Bisulfid-Sequenzierung, reduzierte Repräsentation Bisulfid-Sequenzierung (RRBS), Whole-Genome-Bisulfid-Sequenzierung, MeDIP-Sequenzierungund ChIP-seq.

Referenzen:

1. Gu, H., et al., Genomweite DNA-Methylierungsanalyse klinischer Proben mit Einzel-Nukleotid-Auflösung. Naturmethoden, 2010, (7):133-136.
2. Krueger, F. u. a., DNA-Methylom-Analyse unter Verwendung von kurzen Bisulfit-Sequenzierungsdaten. Naturmethoden 2012,9,145-151.
3. Meissner, A., et al., Reduzierte Repräsentations-Bisulfite-Sequenzierung für vergleichende hochauflösende DNA-Methylierungsanalyse. Forschung zu Nukleinsäuren, 2005, (33):5868-5877.
4. Su J., et al., Fortschritte bei Bioinformatik-Tools für Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten der DNA-Methylierung. Erbgenetik, 2012(1):107.
5. Sun, X. u. a. Eine umfassende Bewertung von Alignierungssoftware für reduzierte Repräsentations-Bisulfid-Sequenzierungsdaten. Bioinformatik, 2018(34):2715-2723.
6. Suzuki, M., et al. Optimiertes Design und Datenanalyse von tagbasierten Cytosin-Methylierungsassays. Genombiologie, 2010(11): R36.
7. Wreczycka, K., et al., Strategien zur Analyse von Bisulfid-Sequenzierungsdaten. Zeitschrift für Biotechnologie, 2017(261):105-115.
8. Chen Y, Pal B, Visvader J E, et al. Differenzielle Methylierungsanalyse von Experimenten mit reduzierter Repräsentation von Bisulfit-Sequenzierungen unter Verwendung von edgeR. F1000Research, 2017, 6.