Ribosomen-Profiling Q&A

Ribosomen-Sequenzierung kann genaue Informationen und präzise Quantifizierung aller translierbaren Moleküle (einschließlich mRNA und anderer potenziell translierbarer RNA-Moleküle wie lncRNA, circRNA usw.) in einer Probe erhalten und ist eine Brücke zwischen dem Transkriptom und dem Proteom.

RNA-Seq kann den Typ und die Menge von mRNA in Zellen widerspiegeln und auch Sequenzvariationen sowie variables Spleißen von mRNA erkennen. Es spiegelt jedoch nicht wider, ob mRNA in das entsprechende Protein übersetzt wird und auf welchem Niveau die Translation stattfindet. Die Translatom-Analyse kann das Niveau, die Region und die Rate der Genübersetzung in Zellen untersuchen, usw.Kombinieren Transkriptom, kleine RNA-Sequenzierungund das Proteom für Korrelationsanalysen, können wir die posttranskriptionale Regulation und die Regulationsmechanismen der Translation präziser untersuchen.

Die Erfassung von Übersetzungsraten kann aufzeigen, welche Gene produziert werden, in welchen Mengen und wann sie benötigt werden. Das Ribosomen-Profiling ermöglicht eine genomweite Überwachung der laufenden Proteinsynthese und ergänzt andere globale Ansätze (z. B. RNA-Sequenzierung). Tatsächlich wurde das Ribosomen-Sequenzieren verwendet, um den Wirkmechanismus von phänotypischen Antibiotika in Bakterien, die Regulationsmechanismen in Pflanzen und Tieren unter Stressbedingungen, die molekularen Mechanismen der altersbedingten Entwicklung bei Individuen und die Mechanismen der Tumorentwicklung, unter anderem, zu untersuchen. Wenn Sie ein Projekt haben, das eine Beratung erfordert, können Sie Kontakt unsere technischen Experten.

Die Poly-A-Schwanzmethode opfert den Ertrag, um die Genauigkeit des 5'-Endes der Bibliothek zu gewährleisten, was entscheidend für eine gute Triplett-Periodizität ist. Der IFR, der auf dieser Methode basiert, liegt bei etwa 50-60 %.
Die Adaptor-Ligationsmethode erzielt eine hohe Ausbeute; jedoch ist die Genauigkeit des 5'-Endes der Bibliothek gering. Etwa 30 % der Reads können nicht mit dem Genom ausgerichtet werden, wahrscheinlich aufgrund der untemplatierten Hinzufügung während der reversen Transkription. Daher ist es notwendig, das erste Fehlanpassungsnukleotid vom 5'-Ende zu entfernen, um eine genaue P-Stelle zu erhalten.

Der Proteinsynthesehemmer Cycloheximid (CHX) wird häufig in Ribo-seq-Experimenten verwendet. Neuere Studien haben ergeben, dass CHX eine transkriptionale Hochregulation von Genen, die an der Ribosomenproduktion beteiligt sind, verursachen kann, was zu einer signifikanten Verringerung der Translationseffizienz führt. Neben der Auswirkung auf die Transkription beeinflusst auch die verwendete CHX-Konzentration die Verteilung der ribosomalen "Fußabdrücke" auf mRNA, wobei niedrige CHX-Konzentrationen eine künstliche Verzerrung verursachen, die durch Erhöhung der CHX-Konzentrationen vermieden werden kann.

Die Verwendung von Ribonuklease (RNase) zum Verdauen von mRNA-Teilen, die sich außerhalb des Ribosoms befinden, ist ein wichtiger Schritt in der Ribosomen-Sequenzierung. Daher ist die Auswahl der RNase und die verwendete Konzentration entscheidend.
Derzeit wird am häufigsten RNase I verwendet. Der größte Vorteil von RNase I gegenüber anderen ist, dass sie keine Basenpräferenz für die Spaltung hat. Bei einigen Arten (z. B. Mensch) ist jedoch die Effizienz, 80S-Ribosomen mit RNase I zu erhalten, gering, und es ist schwierig, die gewünschten 80S-Ribosomen zu erhalten, wenn die Menge an RNase I nicht gut kontrolliert wird. Dies zeigt sich darin, dass bei zu hoher Konzentration von RNase I die Integrität der Ribosomen erheblich beschädigt wird, was dazu führt, dass die endgültige Bibliothek eine große Menge ribosomaler RNA (rRNA) enthält. Ist die Konzentration von RNase I zu niedrig, kann zwar eine gewisse Integrität der Ribosomen aufrechterhalten werden, jedoch werden die ribosomen-geschützten mRNA-Fragmente unvollständig gespalten. Daher ist ein Vortest erforderlich, um die zu verwendende Ribonuklease und die Arbeitskonzentration der Ribonuklease zu bestimmen.

Ribosomen-Profiling Fragen und Antworten